食管鳞形细胞癌及转移性淋巴结组织中CXCL12及其受体CXCR4的表达和临床意义

卢春来 郭 晶 古 杰 葛 棣 丁建勇 林宗武

（复旦大学附属中山医院胸外科 上海 200032）

食管癌是一种常见的恶性肿瘤，2008年全世界范围内食管癌新发病例约为48万，因食管癌致死的患者约40万；包括中国在内的发展中国家食管癌发病率明显高于发达国家，并且这些地区的食管癌病理类型主要为鳞癌［1］。食管癌具有高侵袭性，且易发生转移，尤其表现为淋巴结转移。食管癌患者预后较差，虽然近30年来随着医疗技术水平的发展，食管癌患者5年生存率有所提高，但仅为17%［2］。因此研究食管癌侵袭及转移机制成为目前迫切需要解决的问题。

CXCR4是一种趋化因子受体，研究表明，CXCR4在多种实体恶性肿瘤中高表达，与患者预后密切相关，同时CXCR4与其单一配体CXCL12结合，可以激活下游多条信号通路，从而导致肿瘤转移［3］。本研究检测食管鳞癌患者原发肿瘤及转移性淋巴结组织中肿瘤细胞CXCR4及CXCL12的表达情况，分析它们和患者临床病理特征及预后的关系。

资料和方法

研究对象 收集2006年在复旦大学附属中山医院胸外科行根治性手术的154例胸段食管鳞形细胞患者的石蜡标本（包括肿瘤及正常组织），同时收集45例患者肿瘤转移性淋巴结组织标本。病理诊断由两位病理学专家共同认定，食管癌TNM分期参照AJCC（美国癌症联合委员会）标准（第6版）。

病例一般情况 男性，119例，女性，35例；年龄，38～85岁，平均年龄62岁，其中＞60岁78例，≤60岁76例；按肿瘤分化程度分组：Ⅰ级14例，Ⅱ级114例，Ⅲ26例 ；按肿瘤浸润深度分组：黏膜层及黏膜下层（T1）12例，肌层（T2）41例，全层（T3）95例，侵犯周围组织（T4）6例；按肿瘤大小分组：＜3 c m 69例，≥3 c m 85例；按区域淋巴结转移情况分组：N091例，N163例；按TNM分期分组：Ⅰ期10例，Ⅱa期77例，Ⅱb期13例，Ⅲ期54例。

免疫组化染色 切片常规脱蜡至水，以3%的过氧化氢静置10 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS液冲洗，经抗原微波修复后分别以CXCL12抗体（Cl one 79018，美国 R＆D 公司，稀释浓度1∶300）及CXCR4抗体（Clone 44716，美国R＆D 公司，稀释浓度1∶250）4℃过夜，之后Envision二抗（丹麦DAKO公司）37℃孵育30 min，DAB显色液，苏木精复染、封片。以PBS缓冲液代替一抗，其他步骤不变，结果作为阴性对照。

免疫组化结果的评价 所有病理切片由两位不了解患者病情及研究内容的病理科医师共同判断。参考相关文献报道［4－5］及预实验结果，根据切片中肿瘤细胞数目染色百分比及染色强弱判断CXCL12及CXCR4表达水平，给予相应积分：无表达，计0分；染色百分比≤50%，不管染色强弱，均计1分；染色百分比＞50%，染色弱阳性，计2分；染色百分比＞50%，染色强阳性，计3分。0分和1分定义为低表达，2分和3分定义为高表达。

统计学分析 应用Stata 11．0统计软件。对各指标和患者临床特征进行相关性分析，两组间和多组间比较分别采用 Wilcoxon、Kr uskal－Wallis秩和检验。CXCL12和CXCR4表达水平相关性采用Spear man秩相关检验。原发肿瘤组织与淋巴结转移性肿瘤组织之间CXCL12和CXCR4表达水平比较采用t检验。

按照年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移个数、肿瘤分化、术后化疗以及CXCL12、CXCR4高低表达分组，分别对患者无瘤生存期及总生存期进行生存分析（Kaplan－Meier法），两组或多组生存率采用Log－rank检验（单因素分析）。

以年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、肿瘤分化、术后化疗以及CXCL12、CXCR4表达作为协变量，分别对患者无瘤生存期（disease free survival，DFS）及 总 生 存 期 （overall sur vival，OS）进行Cox回归分析（多因素分析）。

P＜0．05为差异有统计学意义，P＜0．01为差异有显著性统计学意义。

结 果

CXCL12和CXCR4染色表达情况 CXCL12阳性表达主要定位于肿瘤细胞膜和细胞质（图1 A、B）；CXCR4阳性表达主要定位于肿瘤细胞核、细胞质以及细胞膜（图1 C、D），按上述评分标准，CXCL12及CXCR4高表达率分别为53．2%和65．6%。

图1 CXCL12和CXCR4在食管癌原发肿瘤及肿瘤转移性淋巴结组织中的表达情况Fig 1 CXCL12 and CXCR4 expressions in the pri mary and metastatic tumors

相关性比较结果

CXCL12和CXCR4表达水平与食管癌临床病理特征的相关性分析 CXCL12表达水平与患者临床病理学特征（年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及肿瘤细胞分化）无明显相关性，差异无统计学意义（P＞0．05）。不同性别组的CXCR4表达水平有差异，差异具有统计学意义（P＜0．05）；CXCR4表达水平与肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、TNM分期关系密切，差异具有显著统计学意义（P＜0．01，表1）。

表1 CXCR4和CXCL12表达水平与食管癌临床病理特征的相关性分析Tab 1 Analysis of the associations bet ween CXCL12／CXCR4 expressions and clinicopathologic features （n）

原发肿瘤组织中CXCL12和CXCR4表达的相关性分析 原发肿瘤组织中CXCL12和CXCR4表达水平具有相关性（P＝0．014，r＝0．198）。

原发肿瘤组织和肿瘤转移性淋巴结组织中CXCL12和CXCR4表达水平的比较 45例肿瘤转移性淋巴结组织中，CXCR4表达评分均值明显高于与其配对的原发肿瘤组织（2．03 vs．1．84），差异有显著统计学意义（P＜0．01）；而CXCL12表达评分均值虽高于原发肿瘤组织（2．82 vs．1．93），但差异无统计学意义（P＞0．05，图2）。

图2 原发及转移性肿瘤组织中CXCL12和CXCR4免疫组化评分的比较Fig 2 The comparison of CXCL12 and CXCR4 scores bet ween pri mary and metastatic tumors

单因素分析 单因素分析（表2）发现，CXCL12高表达患者DFS及OS低于CXCL12低表达患者，但差异无统计学意义（P＞0．05）；CXCR4高表达患者DFS及OS明显低于CXCR4低表达患者，差异有显著统计学意义（P＜0．01）；CXCL12和CXCR4联合表达阳性的患者，其DFS及OS明显低于CXCL12和CXCR4联合表达阴性的患者，差异有显著统计学意义（P＜0．01）；CXCL12和CXCR4联合表达阳性的患者，其中位DFS低于CXCR4阳性表达的患者（20个月vs．22个月）；年龄、性别、肿瘤浸润深度、分化程度及TNM分期也与患者生存预后相关（P＜0．05）；而肿瘤大小及术后化疗则与患者生存预后无明显相关性（P＞0．05）。另外，区域性淋巴结转移阳性患者DFS及OS明显低于阴性患者，差异有显著统计学意义（P＜0．01，图3）。

多因素分析 Cox回归分析（表3）显示，CXCR4高表达及区域性淋巴结转移是患者DFS和OS的独立预后不良因素（P＜0．05）。而年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化，CXCL12高表达和术后化疗并不是患者DFS及OS的独立预后不良因素（P＞0．05）。

表2 食管癌患者预后的单因素分析Tab 2 Univariate analysis of patients′survival （n）

图3 CXCL12和CXCR4表达水平与患者预后的关系Fig 3 The associations bet ween CXCL12 and CXCR4 expressions and patients′prognosis

表3 食管癌患者预后的多因素分析Tab 3 Multivariate analysis of patients′survival

讨 论

趋化因子系统指的是一些小分子前炎性因子及其受体，它们参与调节感染、炎症以及组织修复相关的免疫反应，并且可以在胚胎形成阶段调控多种细胞的迁移。趋化因子受体CXCR4是由352个氨基酸构成的视紫红质样G蛋白偶联受体。基质衍生因 子 （str o ma－derived f actor 1，SDF－1），亦 称CXCL12，是由68个氨基酸构成的小分子细胞因子，属于CXC趋化因子家族，目前认为CXCL12是CXCR4的唯一配体。CXCR4是肿瘤中表达最为普遍的细胞因子受体，其配体CXCL12则在肺、肝脏、骨髓及淋巴结等肿瘤易于转移的器官中有高表达，由此促成了肿瘤的靶向转移。目前，已在胰腺癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌等研究中证实CXCL12／CXCR4信号轴在恶性肿瘤转移扩散中起关键作用［6］。

关于CXCL12／CXCR4与食管癌侵袭和转移之间的关系，目前相关研究结果并不一致。日本学者的研究［7］表明，CXCL12和CXCR4在食管鳞形细胞癌组织中均为高表达，CXCL12与食管癌患者淋巴结转移、TNM分期具有相关性，且与患者预后密切相关，CXCL12高表达的患者生存时间明显低于CXCL12低表达患者（P＜0．01）；而CXCR4与患者临床病理特征及预后并无相关性（P＞0．01）。然而，另一项中国学者的研究结果表明［8］，CXCR4与患者临床病理特征及预后具有相关性（P＜0．01），尽管CXCL12高表达的患者5年生存率低于CXCL12低表达患者，但其差异无统计学意义（P＞0．05）。本次研究，我们也得到了与中国学者相似的结果，进一步验证了CXCL12和CXCR4在食管鳞癌组织中高表达，且与患者预后有一定的相关性。

为了更加深入的探讨CXCL12和CXCR4在食管癌转移中的作用，我们不仅检测了原发食管癌组织中CXCL12和CXCR4的表达情况，而且还检测了这两个指标在转移性淋巴结中的表达情况。结果发现，CXCL12在转移性淋巴结组织中表达强度略高于原发肿瘤组织（P＞0．05）；而转移性淋巴结组织中CXCR4免疫组化评分明显高于原发肿瘤组织，但差异无统计学意义（P＜0．01）。和配对的原发肿瘤组织相比较，转移性淋巴结组织中CXCR4几乎均为强阳性表达，这一现象也可以说明CXCR4阳性表达的食管鳞癌细胞易于转移，CXCR4在食管癌转移过程中起到非常重要的作用。

本次研究，我们还发现原发肿瘤组织中CXCL12和CXCR4均为高表达，两者表达水平具有显著相关性（P＜0．01），而且CXCL12和CXCR4共同高表达的患者其中位生存期明显低于于CXCL12和CXCR4共同低表达的患者（P＜0．01）。在之前的研究中，我们发现食管癌肿瘤组织中CXCR4与基质金属蛋白酶－9（matrix metalloproteinase－9，MMP－9）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达具有相关性［9］。因此，我们推测食管鳞癌细胞可能通过自分泌CXCL12和CXCR4，两者结合，激活下游相关信号通路，上调侵袭及转移相关蛋白（例如MMP－9、VEGF）的表达，从而促进食管癌的侵袭和转移。在一项关于卵巢癌的研究中，上述的推测已经得到了验证，研究者在体外抑制卵巢癌细胞株中CXCL12及CXCR4的表达，可以显著下调转移相关蛋白，例如MMP－9、u PA的表达水平［10］。

我们的研究仅仅是发现了CXCL12和CXCR4与食管癌转移有一定的相关性，推测CXCL12／CXCR4信号轴在食管癌转移中可能起到重要作用。但是，CXCL12／CXCR4信号轴在食管癌中所激活的具体下游信号通路及关键节点分子的深入探讨则需要进一步的体外体内实验研究。

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