水体碳氮比对芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌生长、拮抗作用及菌体碳氮比的影响＊

高 磊，包卫洋，2，张天文，单洪伟，马甡＊＊

（1.中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东 青岛266003；2.扬州大学海洋科学与技术研究所，江苏 扬州225127）

近年来，养殖水体恶化与病害频发已成为制约对虾养殖业持续发展的主要因素。在对虾传统精养模式中，大量投饵与单一的养殖生态系统令养殖环境十分脆弱，氨氮与亚硝氮等有害物质大量积累；大量换水将外界环境中的致病菌带入到养殖水体中，增加了疾病爆发的风险；此外，养殖后期水体氮元素的大量积累导致环境碳氮比（C∶N）大大降低以至于弧菌病的爆发，这也严重影响着对虾的养殖生产［1］。向养殖水体中投放益生菌不仅可以改善养殖水体的微生态结构组成，使有益菌在水体中占有主导地位，还可以改良水质，抑制有害菌的生长，但是益生菌添加技术也面临着有益菌不能长时间维持，及难以形成优势菌种等诸多问题。因此，如何促进益生菌在水体中的大量繁殖，以及加强益生菌对有害菌的拮抗作用已成为1个亟待解决的问题［2－4］。

通过向养殖水体中添加碳源调节水体的C∶N不仅可以促进异养细菌的大量繁殖，降低氨氮与亚硝氮在水体中的积累［5－6］，还可以通过形成生物絮团为对虾提供更多的天然饵料，降低养殖成本［7］。目前国内外调节环境C∶N的研究工作主要集中在改善水质及促进生物絮团形成等方面，而关于其对养殖水体中主要功能菌与有害菌生长的作用却鲜有报道。本文旨在研究调节水体碳氮比（C∶NW）对芽孢杆菌、乳酸菌与弧菌生长及拮抗作用的影响，并为养殖生产中的C∶N调节技术提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

实验所用细菌于2010年7～10月采集自青岛市宝荣水产科技发展有限公司，舟山市绿源水产科技发展有限公司与湛江市恒兴水产养殖有限公司3处的凡纳滨对虾养殖池塘。将5mL水体样品或5g底质样品（分离芽孢杆菌时需先将样品置于80℃水浴中10 min）加入到装有45mL相应液体培养基的三角瓶内，富集培养后用无菌海水适当稀释，取0.2mL涂布于固体培养基上，采用划线分离法对菌株进行分离，连续划线培养至纯。芽孢杆菌的初步鉴定采用孔雀绿染色法［8］，乳酸菌的初步鉴定采用脱脂乳培养法［9］，弧菌的初步鉴定采用氧化酶法［10］。

1.2 培养基配制

芽孢杆菌的培养使用LB培养基［11］；乳酸菌的培养使用 MRS培养基［12］；弧菌的培养使用TCBS固体培养基与碱性蛋白胨液体培养基［13－14］。

C∶N梯度培养基的配置：将以上3种培养基（LB培养基、MRS培养基、碱性蛋白胨液体培养基）用无菌海水稀释至养殖环境营养水平（TOC＝20mg／L）［15］，并通过添加碳源（葡萄糖）或氮源（（NH4）2SO4），将培养基的C：N分别调节至2、5、10、15、20。

1.3 菌株16SrDNA序列鉴定

采用大连宝生物科技有限公司DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，以基因组DNA为模板采用细菌通用引物对，正向引物27f：5′－AGAGTTTGATC（C／A）TGGCTCAG－3′，反向引物1492r：5′－TACGG（C／T）TACCTTGTTACGACTT－3′，进行16SrDNA的PCR扩增。PCR反应条件为：最初变性95℃5min；变性95℃30s，复性55℃1min，延伸72℃2min，30个循环；最后延伸72℃10min。PCR产物采用大连宝生物科技有限公司DNA回收试剂盒进行纯化，将纯化样品送至中国科学院海洋研究所测序，将所得序列与Genbank中的16SrDNA序列进行Blast相似性分析比较。以16SrDNA基因序列同源性A＞99%为鉴定标准［16－17］。

1.4 细菌筛选

经过初步分离、16SrDNA鉴定共得到芽孢杆菌37株、乳酸菌42株及弧菌50株。在细菌分离培养的过程中发现不同菌株的生长能力差异较大，部分菌株生长速度慢、繁殖能力差，不利于实验结果的观察，因此将所得菌株分别接种在C∶NW较低（C∶NW＝2）与C∶NW较高（C∶NW＝20）的环境中培养48h（培养基配制见1.2节），利用流式细胞仪对培养菌液进行细菌计数，筛选出在2种条件下生长水平均较好的菌株，最终得到4株芽孢杆菌（S4、G6、Z5、S5），4株乳酸菌（S9、Z10、Z13、Z14）与4株弧菌（Z5、Z9、G9、G17）用于后续实验。

1.5 不同C∶NW对3种细菌生长、拮抗作用及菌体碳氮比（C：NB）影响的测定

1.5.1 不同C∶NW下细菌的生长 将芽孢杆菌（S4、G6、Z5、S5）、乳酸菌（S9、Z10、Z13、Z14）及弧菌（Z5、Z9、G9、G17）的种子培养液用无菌海水稀释至103cells／mL水平，分别接种到3种C∶N梯度培养基（见1.2节）中，于28℃下避光培养72h，每6h取样一次，利用比浊法进行细菌培养液吸光度的测定。同时取各菌株不同时期的培养液测定吸光度后用甲醛固定，利用流式细胞仪进行细菌数量的测定，绘制比浊法测定细菌数量的标准曲线，将实验中测得细菌培养液的吸光度换算为细菌密度（cells／mL）。

经上述实验结果得知，不同芽孢杆菌（或乳酸菌、弧菌）的生长对C∶NW的响应方式基本一致，因此选取生长水平较好的芽孢杆菌Z5菌株、乳酸菌Z13菌株及弧菌Z9菌株作为下文实验的菌株。

1.5.2 芽孢杆菌与弧菌的竞争作用 预实验结果表明本实验所筛选芽孢杆菌培养上清液对弧菌的生长无明显抑制作用（数据未显示），因此选用芽孢杆菌与弧菌共同培养时的生长竞争水平来研究2种细菌间拮抗作用的变化。将芽孢杆菌Z5菌株与弧菌Z9菌株的种子培养液用无菌海水稀释至103cells／mL水平，同时接种至LB的C∶N梯度培养基（见1.2节）中，于28℃下避光培养72h，每12h取样一次，将菌液样品用无菌海水稀释至不同梯度后分别涂布于LB与TCBS平板培养基上，利用平板计数法分别进行细菌计数，其中弧菌Z9菌株数量通过TCBS平板计数得到，芽孢杆菌Z5菌株数量通过LB与TCBS平板计数之差得到（已通过预实验验证芽孢杆菌Z5菌株不能在TCBS培养上生长，且弧菌Z9菌株可以在LB培养基上生长）。

1.5.3 乳酸菌对弧菌的抑制作用 由于乳酸菌（主要为厌氧细菌）与弧菌（主要为好氧细菌）的培养环境不同，且乳酸菌主要通过释放分泌物实现对有害菌的拮抗作用［18］，因此选用乳酸菌培养产物对弧菌的抑制水平来研究2种细菌间拮抗作用的变化［9，19－20］。将乳酸菌Z13菌株的种子培养液用无菌海水稀释至103cells／mL水平，接种至 MRS的C∶N梯度液体培养基（见1.2节）中，于28℃下避光培养72h，将菌液于10 000r／min下离心3min，利用牛津杯法测定离心上清液对弧菌Z9菌株生长的抑制作用［21］。

1.5.4 细菌C∶NB的测定 将芽孢杆菌Z5菌株、乳酸菌Z13菌株与弧菌Z9菌株的种子培养液用无菌海水稀释至103cells／mL水平，分别接种到1.2节所述C∶N梯度培养基中，于28℃下避光培养48h，将所得细菌培养液于10 000r／min下离心3min，弃上清液，将菌团用无菌海水反复冲洗3次后于60℃烘干，利用元素分析仪进行碳元素与氮元素含量的测定，通过计算得到细菌的C∶NB。

1.6 数据分析

数据计算平均值、标准差，应用Execl 2010与SPSS11.0软件对实验结果进行统计分析，采用oneway ANOVA方法进行方差分析，利用Tukey′s检验进行显著性检验，采用P＜0.05作为差异显著性的标准。

2 实验结果

2.1 C∶NW对细菌生长的影响

C∶NW对4株芽孢杆菌生长的影响见图1。

4株芽孢杆菌（S4、G6、Z5、S5）的生长对 C：NW的响应结果基本一致，相同菌株在不同C∶NW下的生长水平差异明显。培养24h后4株芽孢杆菌在C∶NW＝15的处理组中生长水平最好，细菌密度最高达到6.75×107cells／mL，显著高于其它处理组（P＜0.05），在C∶NW＝2的处理组中生长水平较差，细菌密度低于1.20×107cells／mL。Z5菌株生长能力较强，在相同环境中生长水平高于其它菌株。

C∶NW对4株乳酸菌生长的影响见图2。

图2 4株乳酸菌（S9、Z10、Z13、Z14）在不同C∶NW下的生长曲线Fig.2 The growth curves of 4lactic acid bacteria（S9，Z10，Z13，Z14）with different C∶N ratios of the water

4株乳酸菌（S9、Z10、Z13、Z14）在C∶NW≥10的环境中生长水平较高，对C∶NW的响应基本一致。培养24h后乳酸菌S9菌株在C∶NW＝20的处理组中生长水平最好，细菌密度最高达到1.32×107cells／mL，显著高于其它处理组（P＜0.05），乳酸菌Z10、Z13及Z14菌株在C∶NW＝10、15的处理组中生长水平最好，细菌密度最高达到2.09×107cells／mL，整体上显著高于其它处理组（P＜0.05）。Z13菌株生长能力相对较强，在相同环境中的细菌密度相对较高。

C∶NW对4株弧菌生长的影响见图3。

图3 4株弧菌（Z5、Z9、G9、G17）在不同C∶NW下的生长曲线Fig.3 The growth curves of 4 Vibrio （Z5，Z9，G9，G17）with different C∶N ratios of the water

4株弧菌（Z5、Z9、G9、G17）的生长对C∶NW的响应结果基本一致。培养24h后4株弧菌在C∶NW＝5、10的处理组中生长最好，细菌密度最高达到5.07×107cells／mL，整体上显著高于其它处理组（P＜0.05），在C∶NW＝2的处理组中生长水平较差，细菌密度低于1.16×107cells／mL。Z9菌株的生长能力相对较强，在相同环境中的细菌密度相对较高。

2.2 C∶NW对细菌间拮抗作用的影响

芽孢杆菌Z5菌株与弧菌Z9菌株在不同C∶NW下的生长结果见表1。

表1 芽孢杆菌Z5菌株与弧菌Z9菌株在不同C∶NW下的密度变化（mean±S.D.）Table 1 The densities of Bacillus Z5and Vibrio Z9with different C∶N ratios of the water（mean±S.D.）

图4 不同C∶NW下乳酸菌Z13菌株培养上清液抑制弧菌Z9菌株生长所产生的抑菌圈直径Fig.4 The inhibition zone diameter of the lactic acid bacteria extracellular products on the growth of Vibrio

当C∶NW＝2，5时，弧菌生长水平较高，细菌密度最高分别可以达到5.79×107与4.40×107cells／mL，显著高于芽孢杆菌的生长水平（＜1.32×107cells／mL；P＜0.05）。当C∶NW＝10、15、20时，在第12与24h，芽孢杆菌的生长水平（最高可达4.04×107cells／mL）显著高于弧菌（＜1.56×107cells／mL；P＜0.05）。

乳酸菌Z13菌株对弧菌Z9菌株的抑制作用结果见图4。

当C∶NW＝10，15时，乳酸菌培养上清液抑制弧菌生长所产生抑菌圈直径＞3.0cm，分别达到3.2与3.1cm，显著高于其它处理组（P＜0.05）。当C∶NW＝2，5时，抑菌圈直径较小，分别为2.0与2.3cm。

2.3 C∶NW对细菌C∶NB的影响

图5 芽孢杆菌Z5菌株，乳酸菌Z13菌株与弧菌Z9菌株的C∶NB在不同C∶NW下的变化Fig.5 The C∶N ratio of Bacillus（Z5），lactic acid bacteria（Z13）and Vibrio（Z9）with different C∶N ratios of the water

整体来说，芽孢杆菌、乳酸菌及弧菌的C∶NB随C∶NW的升高而上升（见图5）。芽孢杆菌C∶NB的变化范围为5.28～7.48，乳酸菌C∶NB变化范围为3.97～5.04，弧菌C∶NB变化范围为5.05～15.12。当C∶NW≥5时，相同C∶NW条件下的弧菌C∶NB显著高于芽孢杆菌与乳酸菌的C∶NB（P＜0.05）。

3 讨论

添加碳源提高养殖水体C∶N是近年来在养殖生产中应用的环境调控方法，通过促进与优化异养细菌的生长往往能起到改善水质的作用［22－24］。然而，细菌因自身构成与代谢类型的不同，其对环境C∶N的响应也有所差异［25］。芽孢杆菌与乳酸菌在养殖生产中具有重要作用，常作为有益菌用于水质的调节与养殖微生态系统的优化，而弧菌在养殖后期往往会集中爆发［1］，常严重影响对虾的生长甚至导致死亡。在对虾养殖生产中，环境C∶N会随着饵料投喂的增加而逐渐降低，探明芽孢杆菌、乳酸菌及弧菌对环境C∶N变动的响应对于养殖生产环境调控技术的开发与优化具有重要意义。

碳元素与氮元素是细菌生长所需要的基本元素，二者的水平直接决定了细菌生长与繁殖的能力。细菌对碳元素与氮元素的吸收主要用于构成菌体的组成及胞外多糖等胞外产物，以及吸收更多的碳元素用于呼吸消耗［6］。整体来讲，海水环境中的细菌在较高的C∶N（C∶N＞10）下生长水平较好［25］，同样也有实验证实通过添加葡萄糖来提高环境C∶N可以明显促进海水细菌的总体生长水平［6］。而在改变水体环境C∶N的过程中，水体中的细菌组成及其多样性也发生了明显变化［26］，这说明不同细菌对环境C∶N的响应与需求水平不同。本文的研究结果表明，芽孢杆菌最适合于在C∶NW＝15的环境下生长，而不适合于在C∶NW＝2的环境下生长；乳酸菌适合于生长在C∶NW≥10的环境中，而弧菌则在C∶NW＝5，10的环境中生长较好。这说明了3种细菌生长环境的最适C∶N不同，芽孢杆菌与乳酸菌在较高水平的C∶NW下生长较好，而弧菌适宜生长的C∶NW显著低于芽孢杆菌与乳酸菌。

芽孢杆菌作为养殖生产中常用的有益菌可以在养殖水体中形成有益的微生物菌群，通过与有害菌竞争空间及营养物质，可以达到抑制有害菌群增殖的目的［27］。从芽孢杆菌与弧菌拮抗作用实验的结果中可以看到，当C∶NW＝2，5时，弧菌生长水平明显高于芽孢杆菌，在环境中占据主要地位，而当C∶NW≥10时，芽孢杆菌生长水平明显超过弧菌，取代弧菌成为水体中的优势菌种。当C∶NW＝2时弧菌的生长水平较高可能是由于弧菌更适合在C∶NW较低的环境下生长以及芽孢杆菌与弧菌间的相互作用导致的，这还需要进一步实验的验证。当C∶NW＝2，5时，培养12h后弧菌的数量水平保持稳定，在实验过程中没有出现下降趋势，这应该是因为弧菌在适宜环境中生长能力较强，通过延长实验时间可观察到弧菌生长的衰亡期。因此在养殖生产中特别是在养殖后期，可以通过提高养殖水体的C∶N来促进芽孢杆菌的繁殖，并通过形成不利于弧菌生长的环境以及芽孢杆菌的拮抗作用来抑制弧菌的生长。

乳酸菌作为水产养殖饲料中常用的有益菌添加剂，是对虾消化道中主要的有益菌之一，可以通过分泌乳酸菌素及其它代谢中间产物或终产物（如乳酸、乙酸等）形成酸性环境来抑制有害菌的生长［18］。从乳酸菌对弧菌抑制实验的结果中我们可以看到，当C∶NW＝10，15时，乳酸菌培养上清液对弧菌的抑制作用明显高于其他处理组（P＜0.05）。这可能是由于较高的C∶NW为乳酸菌生长提供了充足的碳源，使其酸性代谢产物增多，从而强化了对弧菌的抑制作用。因此提高传统饵料中的碳含量，降低氮在饵料中的比重，不仅可以节省成本，减少饵料污染［28－29］，还可以在对虾消化道中形成适合乳酸菌生长的环境，加强其对弧菌生长的拮抗作用，降低疾病发生的机率。

Goldman等［30］与 Wang等［31］的研究表明，海洋细菌在C∶NW从1.5变化到40的过程中，其C∶NB的变化范围为3.77～6.47。本研究中，随着环境C∶NW水平由2上升至20，芽孢杆菌与乳酸菌的C∶NB变化范围为3.97～7.48，变化幅度与前述研究结果相近；而当C∶NW≥10时，弧菌的C∶NB＞12，最高达到15.12，远高于弧菌在普通培养条件下的C∶NB（5.79），这表明C∶NW的提高影响了弧菌的菌体组成。Goldman等［32］的研究发现，将海水细菌进行连续性培养时，在C∶NW从5变化到30的过程中，细菌C∶NB从4.5变化到13.0，并推测这可能是由细菌极低的生长率及受到影响的菌体生理结构造成的。细菌在环境不良时其代谢类型可由初级代谢转变为次级代谢，并分泌产生多糖类物质来抵御不良环境［33－34］，这可能是导致弧菌C∶NB明显升高的原因之一，也提示了弧菌不适合于生长在较高C∶NW（≥10）的环境中。因此C∶NW对细菌C∶NB的影响导致了不同细菌的生长对C∶NW的响应有所不同，这为今后进一步研究C∶NW对细菌生长的作用奠定了理论基础。

4 结论

综上所述，通过添加碳源提高至C∶NW≥10的水平不仅可以促进芽孢杆菌与乳酸菌的生长，还可以形成不利于弧菌生长的环境，同时能够加强芽孢杆菌与乳酸菌对弧菌生长的拮抗作用。因此向养殖环境和饵料中添加碳源，将碳源添加技术与添加芽孢杆菌、乳酸菌等益生菌技术相结合，可以成为促进益生菌繁殖，优化养殖水体微生态系统的有效措施，同时也为防止养殖后期由于养殖水体C∶N过低导致弧菌爆发提供了可行途径。

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