酶定向固定化方法及应用的研究进展

李存存，张光亚

（华侨大学化工学院，福建 厦门 361021）

传统酶固定化一般认为是通过酶分子上的氨基酸残基（如赖氨酸残基）随机固定在载体上，这可能会导致酶多个位点和载体结合，破坏了酶天然构象或者出现位阻障碍而妨碍底物进入到酶的活性位点，最终使固定化酶活性大幅度下降[1-3]。Hernandez等[4]认为传统的固定方法并不是完全随机的固定而可能是目标蛋白取向很难改变，蛋白质固定化方向难以把握。邵文海等[5]认为酶分子不适合的空间取向使得与底物发生邻近定向效应受阻，催化作用减弱。而定向固定能够按照设定的位置把酶固定在载体上，这更有利于保护酶催化功能，具有更重要的研究与应用价值。采用定向固定化的方法固定化酶，可使酶特定位点直接[6-7]或间接[8-9]与载体结合，酶活性位点位于载体外侧，天然构象基本保持不变，有利于底物进入到酶活性位点，显著提高固定化酶的活力。如Holland等[10]将乙醛/酮还原酶AKR1A1（EC 1.1.1.2）连接一段生物素标签后，定向固定在带有链霉亲和素的载体上，固定化酶活性比随机固定提高了60～300倍，4℃条件下储存，7天后酶活保持不变，50天后的酶活仍保持35%，稳定性很好。

目前发展的定向固定化方法主要有：非共价定向固定，主要是抗体与抗原，亲和素/链霉亲和素与生物素以及组氨酸标签与 Co2+/Ni2+之间的亲和作用；共价定向固定，主要是通过半胱氨酸残基上的巯基与载体直接或间接作用。

本文主要综述了酶的定向固定方法，并把其与传统固定化进行了比较，简述了定向固定化酶在生物传感器、分子识别、酶生物燃料电池及酶纯化方面等领域的应用。

1 非共价定向固定

1.1 抗体与抗原之间的亲和作用

若酶作为抗原时，可直接根据抗原抗体之间的亲和作用定向固定，羧肽酶A （Carboxy peptidase，CPA）和它的抗体形成复合物的亲和常数可达 109L/mol，这样羧肽酶 A就可以直接与其抗体紧密结合而固定。另外，若酶分子不能作为抗原，则通过基因融合方法在酶分子的C端或N端融合一段多肽标签序列，然后酶通过亲和作用定向固定在抗多肽标签的抗体上（图 1）[4]，用这种方法定向固定来自大肠杆菌的碱性磷酸酯酶[11]（Escherichia coliAlkaine Phosphatase ，EAP），固定化后酶活力为原来的85%。蛋白质A（蛋白A是金黄色葡萄球菌的一种胞壁成分，由单一肽链组成）与抗体有很强的结合能力，因而可先在载体上固定化蛋白质A，然后连接目标酶对应的抗体，最终通过亲和作用定向固定。这种定向固定的方法适用于酶分子的活性中心背对着其N端或C端氨基酸残基，同时融合在酶分子上的标签不能影响其天然结构。

1.2 亲和素/链霉亲和素与生物素之间的亲和作用

亲和素或链霉亲和素的亚基可通过专一而又特定的非共价键连接到生物素（解离常数KD为10−15～10−16mol/L）上，这种非共价之间的作用非常强，接近共价键[12]。此外这种非共价连接具有抗热，耐酸碱及不被蛋白酶水解等优点。

通常有两种方法来预处理目标蛋白， 一是生物素酰化目标蛋白，如，E.coli生物素连接酶（BirA）催化依赖ATP的受体肽上的赖氨酸残基生物素化，在生物传感器和细胞识别上具有潜在的应用价值[13]。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPTase）可将生物素化辅酶 A上的 4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移到酰基或肽基载体蛋白。Chirra等[14]首先利用琥珀酰亚胺使得过氧化氢酶生物素酰化，然后把生物素酰化的Au纳米颗粒与链霉亲和素连接，进而过氧化氢酶通过亲和作用与纳米颗粒连接。葡萄糖氧化酶也可以利用这种方法固定在去铁铁蛋白纳米颗粒上[15]，固定后的葡萄糖氧化酶酶活力保持约为100%，Km值（酶反应速度为最大值的一半时的底物浓度）与自由酶类似，具有很高的稳定性。另一种是把目标蛋白融合到带有亲和素或链霉亲和素的亲和标签上[16-17]。Dib等[18]于E.coli中表达带有链霉素的D-氨基酸氧化酶重组蛋白，通过亲和作用定向固定在D-Strep-Tactin MacroPrep颗粒上。与通过组氨酸标签固定在镍螯合基质上的 D-氨基酸氧化酶（Rhodotorula gracilis）[19]相比，此种方法固定的酶，酶活回收率为80%，经过20次缓冲液清洗后，活性保持不变，稳定性极大提高。Wang等[20]也通过生物素与链霉亲和素的亲和作用定向固定 D-氨基酸氧化酶于磁性微球上，结果表明，固定化后酶催化效率及稳定性都有极大提高。Miladi等[21]将烟草蚀纹病毒蛋白酶定向固定在链酶亲和素琼脂糖上，与自由酶相比，固定化的野生型和突变型的烟草蚀纹病毒蛋白酶活性分别保持原有活性的 83%和81%，经过18个月，9个批次反应，酶活回收率分别为38%和51%。这种固定化方法克服了链霉亲和素在E.coli中溶解度较小的问题[22]，把融合有亲和素的目标酶的剪切和纯化同步完成。

与其它非共价键固定相比，这种定向固定化方法与目标酶的的相互作用更强，因而应用比较广泛。其缺点是固定过程较其它非共价固定复杂且亲和素（69 kDa）和链霉亲和素（60kDa）分子较大，可能会影响目标酶空间结构[23]。

1.3 多聚组氨酸标签与Co2+/Ni2+之间的亲和作用

利用多聚组氨酸标签与金属螯合物或金载体之间的亲和作用固定酶已有很多报道。一般用于固定化的过渡金属离子有Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或 Fe3+，其中主要是Co2+/Ni2+。组氨酸残基上的咪唑环可与这些过渡金属形成稳定的螯合键[9，24]，为了捕获二价过渡金属离子，固定化材料首先通过次氮基三乙酸（氮川三乙酸）或亚氨基二乙酸修饰。这种方法广泛用于固定化金属离子亲和层析技术（immobilized metal ion-affinity chromatography，IMAC）纯化蛋白。酶回收时添加一个竞争性配体（例如咪唑或组氨酸）或通过EDTA络合作用移除金属离子，因而固定过程是可逆的。该方法固定化酶在多壁碳纳米管和碳纳米球原理如图2所示。

目前通过这种方法定向固定化酶的报道较多，如Nakamura等[25]在Trichoderma viride中表达组氨酸标签-内切葡萄糖酶Ⅱ重组蛋白，通过亲和作用定性固定在氮三乙酸三钠-Ni2+功能的金纳米颗粒上。内切葡萄糖酶Ⅱ活性与自由酶稍有降低，稳定性更好。已报道的定向固定化酶如表1所示。一般而言，固定在纳米颗粒上的酶回收率高于微米以上的载体，可能是由于纳米颗粒比表面积较大[26]。

这种非专一性定向固定化酶的优点是从粗酶液中直接固定而不用提前纯化目标酶；酶与载体之间结合较紧密，克服了酶泄漏问题；固定酶的天然构象保持不变，活力很高；固定化过程可逆，载体可回收重复利用。

1.4 其它的亲和标签

目前用于亲和定向固定化的标签还有金结合肽，氧化锌结合肽，氧化铁亲和肽和二氧化硅亲和肽等，这些亲和标签与酶亲和作用很低，通过重复标签或者载体表面覆盖一层聚合物加强酶与载体之间相互作用，一般固定化后用于生物催化。Sarikaya等[39]首先通过基因工程方法合成金结合肽用于结合无机物，研究发现，3个重复金结合肽有较高亲和性结合。Kacar等[40]于E.coli中分别表达不同重复金结合肽碱性磷酸酶重组蛋白，并定向固定在金表面，表明5个重复金结合肽碱性磷酸酶重组蛋白酶活最高。另外，卤代烷烃脱卤酶分别与铁氧化物亲和肽或2个重复的二氧化硅亲和肽连接。与磁性纳米颗粒之间的弱亲和作用可以通过纳米颗粒表面涂有亲水的聚乙二醇或三甲氧基硅烷克服[41]。

利用非共价定向固定的优点是：酶与固定载体之间的相互作用专一，稳定；固定化过程可逆，固定化材料可重复利用。缺点是在复杂的催化条件下酶容易从载体上脱落。

2 共价定向固定

2.1 通过半胱氨酸残基固定

表1 已报道的通过多聚组氨酸标签定向固定酶

最简单和灵活的酶定向固定化是通过酶分子本身含有的半胱氨酸残基或特定位点上基团反应[43-44]，从而使酶和载体在特定位点进行固定。Wang等[42]于Kluyveromyces lactis中表达含有半胱氨酸残基的β-半乳糖苷酶与硫代亚磺酸酯琼脂糖形成很强的二硫键而定向固定。并探索了固定化β-半乳糖苷酶反应器，结果表明在反应器内酶活可保持56%，稳态条件下，乳糖水解达到80%，固定的β-半乳糖苷酶循环利用4次后，活力保持不变。

如果目标酶多个位点含有半胱氨酸残基，这种方法就无法实现定向固定，因此Becker等[7]利用自然化学连接（native chemical ligation，NCL）法定向固定了GTP酶，即一个肽的N端半胱氨酸残基与另一肽C末端的硫酯形成酰胺键，这种定向固定不要求目标酶只含有一个半胱氨酸，只需在N端有半胱氨酸残基或C端有末端硫酯，相应的载体上连有半胱氨酸或者硫酯。Lin等[6]将唾液酸合成酶与内含肽融合，在巯基乙烷磺酸中使目标酶C端硫酯化，进而将其定向固定在半胱氨酸修饰的磁性纳米颗粒上。定向固定化酶活保持原来的 76.8%，而随机固定仅为 33.2%。这种方法的缺点是内含肽分子过大可能会影响目标酶的活性。

2.2 通过点击化学或Staudinger连接反应固定

点击化学反应（“Click” Chemistry）[45]是通过Cu(Ⅰ)催化，炔基与叠氮基反应生成区域选择性的1,4-三唑，反应机理如图 3所示。该反应在药物开发和生物医用材料等的诸多领域中已经成为目前最为有用和吸引人的合成理念之一。炔基与叠氮基分别连接到目标酶和固定载体上，反应后形成共价键而定向固定。

蛋白脂肪酸转移酶可以把含有叠氮基或者炔基的脂肪酸焦磷酸的脂肪酸部分转移到CaaX肽（其中a是脂肪酸部分，X可以是丝氨酸，甲硫氨酸，谷氨酸，丙氨酸或者苏氨酸）。例如 Gauchet等[46]通过基因融合的方法在绿色荧光蛋白，增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和谷胱甘肽转移酶的C末端连有CaaX肽，用叠氮基团或炔基进行修饰后就可以定向固定在玻璃表面或者琼脂糖小球上，固定化的eGFP与其自由的形式具有相同水平的荧光强度，而且CaaX肽对目标酶影响很小。这种定向固定化的缺点是其它含有CaaX肽的酶也会被固定，因而固定之前需对酶进行纯化。Brennan等[47]于Thermomyces lanuginosus中表达含有赖氨酸残基脂肪酶，通过碳化二亚胺耦合反应获得乙炔基脂肪酶，利用点击化学反应将其定向固定在金纳米颗粒上。结果表明平均每个纳米颗粒上有 7个完全的脂肪酶。Gole等[48]和Schlossbauer等[49]分别用类似的方法定向固定胰蛋白酶于金纳米颗粒和介孔氧化硅上，结果表明定向固定的胰蛋白酶活力要远远高于随机固定。这种定向固定化具有条件温和，固定的共价键连接紧密而且不可逆等优点，但是铜作为催化剂的毒性及不稳定性仍然有待进一步解决。

Staudinger连接反应 2000年由 Saxon 和Bertozzi 发展，一般位于三芳膦上的亲电基团（如甲酯）捕获氮杂叶立德（亚胺基膦烷）中间体，在水介质中进行作用，重排后得到分子内酰胺基氧化膦（图4），Staudinger 连接反应在化学生物学中有很广泛的应用，如此反应可用于荧光标记的核苷的合成。Kalia等[50]在牛胰核糖核酸酶的C端连有叠氮基，金表面涂有磷硫酯键修饰的自组装单分子膜，通过Staudinger连接反应定向固定酶在金表面。固定化后酶活力没有损失，固定化酶可以与其抑制剂形成蛋白质微阵序列。与点击化学相比，这种方法不需要加入有毒物质Cu，但是反应过程较慢或者无法完全反应。

2.3 酶催化的共价固定

目前，酶催化的目标酶定向固定报道见表 2，微生物谷氨酰胺转胺酶催化自由胺基与蛋白质或含有谷氨酸残基肽的氨甲酰基形成共价键，这种酶可以识别特定的氨基酸序列例如MLAQGS或 LLQG等，Moriyama等[51]报道利用微生物谷氨酰胺转胺酶催化细菌碱性磷酸酶定向固定在磁性纳米颗粒上，固定化酶活力为自由酶的90%以上。类似的还有分炼酶A（Staphylococcus aureus）把蛋白转移到细胞壁上，此酶从蛋白C端附近保守序列 LPXTG的甘氨酸与苏氨酸残基中间切开，苏氨酸上的羧基和聚甘氨酸或脂肪胺的氨基形成酰胺键。与点击化学反应和Staudinger连接反应相比，酶催化的共价固定具有条件温和、专一性强等优点。但是目标酶需要连有一段多肽标签序列，这会对酶的构象造成不利影响而使酶活力降低。

3 定向固定化酶的应用

3.1 生物传感器

具有生物催化能力的酶与传感器材料如碳同素异形体或金属纳米粒子相结合形成高效的传感器来分析目标产物。Yang等[38]报道金结合肽（GBP）融合有机磷水解酶重组蛋白固定在涂有石墨烯的金纳米颗粒上形成电化学传感器，这种人工制造的流动注射生物传感器可以快速检测农药含量，具有较短响应时间、低检测限和高灵敏度等优点。

3.2 蛋白质微阵列

酶固定在固体支持物表面形成的蛋白质微阵列可用于少量分析物进行高通量实验[57]。Soellner等[58]通过 Staudinger连接反应固定核糖核酸酶 S′（缩短的RNase S）在玻璃片表面形成微阵，其酶活力保持约 92%，目前广泛应用在 RNase 保护检测，去除非特异结合的RNA，分析RNA 序列，水解蛋白样品中的RNA，纯化DNA等。类似应用的例子还有牛胰核糖核酸酶[50]等。

3.3 分子识别

Dizler等[59]报道来源于E.coil二氢叶酸还原酶（ecDHFR）通过半胱氨酸残基共价固定在金表面，固定化酶的活力与自由酶相等。并研究了固定ecDHFR的活性位点与其强抑制剂甲氨蝶呤的解离力，结果表明ecDHFR与甲氨蝶呤是通过活性位点特异性相互作用，这为生物大分子的力光谱学（force spectroscopy）应用打开了大门。

表2 已报道的酶催化的共价定向固定化酶

3.4 酶生物染料电池

电极和酶之间的高效接触在酶生物燃料电池领域至关重要[60]。Holland等[61]报道通过基因改造表达活性中心具有二硫基团的葡萄糖氧化酶，与带有马来酰亚胺基的金纳米颗粒形成共价键而定向固定，定向固定化的酶和电极之间之间高效接触。在酶生物染料电池和生物传感器方面有着潜在的应用价值。

3.5 酶的纯化

固定化金属离子亲和层析（IMAC）技术就是定向固定在酶纯化上应用的例子。Cano等[19]在酵母菌Rhodotorula gracilis中合成了嵌合有组氨酸标签的 D-氨基酸氧化酶并在E.coli中完全表达，含有组氨酸标签 D-氨基酸氧化酶粗酶液通过多聚组氨酸标签与Ni2+之间的亲和作用定向固定在柱子上形成螯合物，随后用含有咪唑的缓冲液把酶洗脱下来，纯化的 D-氨基酸氧化酶具有全酶活性，在 25℃下比酶活为115 U/mg，产率为82%。这种定向固定方法降低了生物催化剂的成本，为蛋白质的下游加工过程提供了一个工具。

作者课题组设计了一种新型类弹性蛋白多肽ELPs作为非色谱纯化标签与目标酶融合在一起在E.coli中表达，ELPs相变聚集成颗粒定向固定目标酶进行纯化，纯化后酶的回收率约为 21.2%，纯化倍数约为 3.2[62]。通过这种方法定向固定化木聚糖酶的最适温度、最适pH值均与自由酶相同，Km值（6.18 mmol/L）与自由酶接近，稳定性有很大的提高，有望开发成一种新的定向固定化酶方法。

4 展 望

定向固定化酶技术因其较高的活力，良好的稳定性和保持酶的天然构象等优点而吸引着国内外越来越多研究者的关注。目前，定向固定化酶技术仍处于实验研究阶段，并没有在工业生产中大规模应用。主要存在的问题有：目标酶与载体多位点固定造成酶失活，固定化酶在载体上的位阻，固定化标签造成酶的活性降低，固定化的条件剧烈，对酶活力影响较大，固定化过程复杂。为了克服这些不足，今后的研究重点是探索新的定向固定化标签降低对酶活性部位的影响，应用新的载体以提高固定化酶的活性回收率，优化固定化过程或简化固定化步骤等。

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