热疗对增强阿霉素治疗神经胶质瘤敏感性研究

王向军

郑州大学第二附属医院药剂科 郑州 450014

神经胶质瘤（glioma）又称胶质细胞瘤，是起源于神经外胚层细胞多种肿瘤的总称，其恶性胶质瘤在原发性肿瘤中占35%～45%［1］，是中枢神经系统最常见且最难治疗的恶性肿瘤，手术切除、放疗及化疗等传统治疗方法能够对其产生一定的治疗作用，但在过去的很多年中，神经胶质瘤的预后及自然发生、发展过程并未得到明显改善，因此开发治疗神经胶质瘤有效的新方法势在必行。

肿瘤热疗（tumor hyperthermia）是近年来快速发展起来的一类治疗癌症的新方法，基本原理是利用外加的物理能量（如温热水浴、微波或超声波等）加热，使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度，破坏肿瘤细胞的代谢和结构，从而杀灭肿瘤细胞。目前，肿瘤热疗成为继手术、放疗、化疗和免疫疗法之后的第五大疗法。阿霉素（adriamycin，ADM）是一种目前临床常用的广谱抗癌药，用于多种肿瘤的治疗，具有热疗增敏性和PH敏感性。将热疗与化疗联合应用可对化疗起到增效作用。本实验旨在探讨U251细胞株对阿霉素的热疗增敏作用。

1 材料和方法

1.1主要试剂和仪器DMEM培养基（Hyclone公司）、胎牛血清（四季青公司）、磺酰罗丹明B（sigma公司）、阿霉素（万乐药业）、FITC标记的P－gp抗体和山羊抗小鼠IgG1（eBioscience公司）、细胞凋亡试剂盒（碧云天生物技术研究所）。酶标仪（DYNEX公司）、流式细胞仪（贝克曼库尔特有限公司）、UHR－2000高能聚束微波热疗机（华源医疗设备有限公司）、高效液相色谱仪（岛津公司）。细胞培养：将U251神经胶质瘤细胞培养在含胎牛血清（FBS）10%、青链霉素混合液1%的DMEM培养基中，培养箱条件为37℃、5%CO2，每2～3d传代一次。药物工作浓度确定：阿霉素设0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg／mL组，每组3个复孔，SRB法测定细胞抑制率，以48h的IC50作为工作浓度。

1.2实验分组及处理实验设空白对照组、热疗组、化疗组、热化＋疗组。以上各组分别给予相应的化疗和（或）热疗处理：将U251细胞浓度调整为2.5×105／mL种于6孔板中，化疗组和热化疗组中加入工作浓度的阿霉素，热疗组和热疗＋化疗组细胞在UHR－2000微波辐射器下进行加温，温度达42℃时，维持60min。

1.3台盼蓝拒染法检测细胞的存活率分别取各组细胞悬液稀释，使各组细胞数相同，分别吸出0.9mL均匀细胞液加0.1mL 0.4%的台盼蓝染色，计数3次取均值。细胞生存率＝活细胞总数／（活细胞总数＋死细胞总数）×100%。

1.4 SRB法测定细胞增殖率将U251细胞以每孔5×103个接种到96孔培养板中，每组设5个复孔，将各组细胞分别给予热疗、化疗或热疗＋化疗处理。培养48h后加入50%三氯醋酸50μL，4℃固定1h；超纯水洗5遍，风干；加0.4%的SRB 50μL，避光染色30min；1%乙酸洗5遍，风干，加入10mmol／L Tris碱150μL溶解，酶标仪测定吸光度。计算公式：细胞存活率／%＝（1－实验组光吸收值）／对照组光吸收值×100%。

1.5流式细胞仪测定细胞凋亡率用PBS洗涤处理48h的细胞2次，每组（1～5）×105细胞；加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Annexin V－FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5～15min；1h内，用流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。

1.6高效液相色谱法HPLC测定细胞内阿霉素浓度U251细胞反复冻融离心，取上清为细胞内液，用HPLCA法测定细胞内阿霉素含量。测定条件：色谱柱：Agilent 1200E－clipse XDB－C 18柱（4.6mm×150mm，5μm）；检测器：荧光FLD检测器；流动相：甲醇：0.01mol／mL磷酸二氢钾：冰乙酸＝68∶32∶0.5；流速：1.0mL／min；柱温30℃；进样量40 μL；检测波长：激发波长480nm，发射波长550nm［2］。

1.7流式细胞仪测定U251细胞内Bcl－2的表达情况取U 251细胞接种于六孔板中，每孔细胞数为2×105个，分组处理后继续培养48h收集细胞，加入100μL破膜剂及5μL Bcl－2／FITC和 Mouse IgG1／FITC，使用流式细胞仪检测。

1.8流式细胞仪测定U251细胞内P－gp的表达情况取U251细胞接种于六孔板中，每孔细胞数2×105个，分组进行处理后继续培养48h收集细胞，用PBS洗涤，加入10μL的P－gp／FITC和 Mouse IgG1／FITC，将反应物置于37℃冰箱内孵育60min，使用流式细胞仪检测。

1.9统计学处理方法应用SPSS 17.0软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差表示，计量资料采用单向方差分析（One－way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1阿霉素工作浓度的确定SRB法测得浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg／mL的阿霉素分别作用于 U251细胞后，各组抑制率分别为3.22±0.31、9.67±0.95、25.47±2.45、33.89±3.33、57.48±4.01、74.51±4.62、92.64±5.63。U251对阿霉素的IC50为1.45μg／mL，并以此药物浓度进行各项试验。

2.2细胞存活率通过以上方法对U251细胞进行处理48 h后，热疗组、化疗组、热疗＋化疗组的存活率均比空白对照组细胞存活率低，差异有统计学意义（P＜0.01）；热疗＋化疗组的细胞存活率分别比单纯化疗组和单纯热疗组显著降低（P＜0.01）。见表1。

2.3细胞抑制率化疗、热疗及热疗＋化疗组均对U251细胞产生抑制作用；同时化疗组、热疗组与热疗＋化疗组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）。数据见表1。

2.4阿霉素联合热疗对U251细胞的凋亡作用化疗组、热疗组及热疗＋化疗组细胞凋亡率分别较对照组明显升高（P＜0.01）；同时，热疗＋化疗组的细胞凋亡率较热疗组及化疗组的凋亡率均明显升高（P＜0.01）。见表1。

2.5热疗对U251细胞内阿霉素浓度的影响经热疗处理后，细胞内 ADM 浓度由（9.03±0.84）pg／mL上升至（36.52±2.97）pg／mL，差异有统计学意义（P＜0.01）。说明热疗能提高U251细胞对ADM蓄积的能力。见表1。

2.6 U251细胞中Bcl－2的表达按照试验操作处理48h后，检测U251细胞内Bcl－2的表达率。结果显示：化疗组、热疗组及热疗＋化疗组细胞中的Bcl－2表达率与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01），且热疗＋化疗组细胞Bcl－2表达率分别与热疗组、化疗组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

2.7 U251细胞中P－gp的表达按照试验操作处理48h后，检测U251细胞内P－gp的表达率。结果显示：化疗组、热疗组及热疗＋化疗组细胞中的P－gp表达率与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01），且热疗＋化疗组细胞P－gp表达率分别与热疗组、化疗组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

3 讨论

由于肿瘤组织及其周围血管对温度的敏感性，利用热疗的方法可有效将其杀灭［3］。近些年，肿瘤热疗受到了人们的广泛关注［4－5］。同时，热疗和化疗联合治疗肿瘤具有明显的增强作用，原因可能是热疗使药物渗入细胞量增加、蛋白质变性及化疗药物的药动学改变等。本研究使用的化疗药物为阿霉素，阿霉素是一种有效的热疗增敏剂，将其与热疗联合可以有效增强治疗效果［6－7］。

有文献报道，热疗杀灭肿瘤细胞的临界温度是42℃，目前临床上所用的热疗温度也大都是41～43℃，因此本研究中热疗的处理温度设定为42℃。细胞存活率、细胞抑制率及细胞凋亡率的考察结果显示，热疗＋化疗组与单纯热疗组、单纯化疗组及空白对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）；进一步测定细胞内ADM的浓度，发现热疗＋化疗组的ADM浓度比其他组明显升高，原因可能是热疗使药物渗入细胞量增加，此外热疗能够降低瘤组织的pH值，ADM在pH值相对较低的情况下会加强释放进入细胞内部［8］；热疗＋化疗组细胞的P－gp蛋白及Bcl－2蛋白的表达均明显下调节（P＜0.01），这说明热疗可能通过降低多药耐药蛋白P－gp的表达，使化疗药物的外排下降，细胞内药物浓度提高，从而增加了U251细胞对ADM化疗的敏感性。同时多数研究也相继表明，热疗可有效降低细胞内P－gp的表达和Bcl－2的表达［9－10］。

本研究结果表明，热疗联合化疗能增强ADM对U251细胞的体外抑制作用，提高肿瘤细胞凋亡率，增强细胞内ADM累积量，联合热疗可有效下调P－gp及Bcl－2蛋白的表达。总体来说，提高了U251细胞对阿霉素化疗的敏感性。这为神经胶体瘤的治疗提供了一种新的手段，但此方法仍需更多的实验支持，为临床应用提供充分的依据。

表1 U251神经胶质瘤细胞存活率、抑制率、凋亡率及热疗对细胞内阿霉素浓度的影响 （s，%）

表1 U251神经胶质瘤细胞存活率、抑制率、凋亡率及热疗对细胞内阿霉素浓度的影响 （s，%）

注：与空白对照组比，＊P＜0.01；与化疗组比，△P＜0.01；与热疗组比，○P＜0.01

3 98.72±0.02 － 1.56±0.14 －热疗组 3 50.58±3.54＊ 45.74±2.36 20.49±1.97＊ －化疗组 3 43.98±3.27＊ 52.25±4.91 16.33±1.69＊ 9.03±0.84＊热疗＋化疗组 3 25.95±2.21＊△○ 71.37±5.42＊△ 45.36±3.97＊△○ 36.52±2.97空白对照组＊△○

表2 U251细胞经过热疗、化疗及热疗＋化疗处理后Bcl－2及P－gp表达的情况 （s）

表2 U251细胞经过热疗、化疗及热疗＋化疗处理后Bcl－2及P－gp表达的情况 （s）

注：与空白对照组比，＊P＜0.01；与化疗组比，△P＜0.01；与热疗组比，○P＜0.01

组别 P－gp Bcl－2空白对照组76.5±3.2 74.89±4.5热疗组 53.9±4.9＊ 59.14±5.0＊化疗组 50.3±4.6＊ 65.67±3.8＊热疗＋化疗组 25.2±3.7＊△○ 40.52±3.6＊△○

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