突变型Notch 3（R90C）蛋白调控自噬诱导VSMC细胞凋亡的分子机制

丁雪冰 王雪晶 马明明 朱 清 邵凤民△

1）河南省人民医院肾病风湿科 郑州 450003 2）郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 3）河南省人民医院神经内科 郑州 450003

伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）是最常见的遗传性卒中疾病。本病病理改变是一种非动脉硬化性、非淀粉样变性，小动脉病，嗜锇颗粒（granular osmiophilicmateria，GOM）的沉积于血管平滑肌基底膜是它特征性病理改变［1］。其发病与Notch3基因突变导致小血管平滑肌细胞退行性改变相关［2］。

1993年Tournier－Lasserve等首次从两个法国CADASIL家系中，应用遗传连锁分析方法将CADASIL基因定位于19p12内D19S221至D19S222区间的14cM的区的Notch3基因［3］。Notch3基因在CADASIL的发病过程中的重要性已经得到公认，但是其表达的蛋白在发病中机制如何至今尚不能确定。2002年Utku教授首次在土耳其的一例CADASIL家系中发现了Notch3基因R90C突变［4］。R90C突变存在于Notch3基因的第三个外显子区域，编码细胞外区表皮样生长因子重复序列（EGF－like）的胞外段，免疫组织化学研究显示，携带此突变的患者，其小动脉血管平滑肌细胞Notch3胞外段清除障碍，在细胞膜大量堆积本病病理改变是一种非动脉硬化性、非淀粉样变性，小动脉病，嗜锇颗粒（granular osmiophilicmateria，GOM）的沉积于血管平滑肌基底膜是它特征性病理改变［5］。但Notch3（R90C）突变蛋白的具体致病机制，至今仍未明确。

1 材料与方法

1.1材料Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C）质粒由北 京 赛 诺 基 因 有 限 公 司 （www.sinogenomax.com／en／default.aspx）构建合成。大鼠主动脉血管平滑肌细胞A10由加拿大多伦多大学Jane McGlade博士惠赠。DMEM培养基、OPTI－MEM培养基、胎牛血清（FBS）购于美国GIBCO公司，转染试剂脂质体Lipofectamine TM 2000购于美国Invitrogen公司，抗Beclin 1抗体购于美国Abcam公司、LC 3抗体购于Eptimics公司、GAPDH抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司；过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购于美国Promega公司。MDC购于Sigma公司。

1.2细胞培养及转染A10细胞常规培养于10%FBS的DMEM完全培养液中。待细胞铺满培养瓶底30%～40%后，弃去DMEM，每孔加入1mL OPTI－MEM，将3%5μL的质粒及2.0μL lipofectamine TM 2000分别与100μL OPTIMEM混匀后，共同加入六孔板的每个孔中，混匀，在37℃，5%CO2的培养箱中孵育6h，改用含10%FBS的DMEM培养基继续孵育48h。

1.3 Western blot检测细胞Beclin 1蛋白及LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值SH－SY5Y 细胞分别转染 Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C）48h后，提取细胞总蛋白，做 SDS－PAGE电泳，将蛋白样本转移至硝酸纤维滤膜上。用5%脱脂奶粉封闭1h，TBST洗3次，加入抗Beclin 1（1∶800）、抗LC3（1∶300）抗体，4℃过夜。加人过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1∶5000），置于水平脱色摇床上孵育2h，TBST漂洗3次，ECL光化学法显色。凝胶成像分析系统分析扫描。

1.4 MDC检测细胞自噬空泡变化MDC是一种自噬空泡的标志物，可以通过MDC染色观察判断细胞自噬过程的发生。SH－SY5Y细胞分别转染 Flag－N1、Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch 3（R90C）24h后，以4%多聚甲醛，4℃下固定10 min，PBS洗3遍，加入终浓度为50μmol／L的MDC染色液，37℃下孵育60min，PBS洗3遍，荧光显微镜下观察细胞自噬空泡的变化。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡A10细胞分别转染Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C）24h后，取100μL细胞悬液加入5μL Annexin－／FITC和20μg／mL PI溶液10μL，混匀后室温避光孵育15min，加入400μL PBS，以流式细胞仪PI／Annexin－V－FITC检测细胞凋亡情况。

1.6统计学分析Alpha Ease FC（FluorChem8900）软件分析图像，实验数据采用均值±标准差（s）表示，所得实验数据用SPSS 13.0统计软件行方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测细胞内源性Beclin 1蛋白、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的表达在 A10细胞内过表达Flag、Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C），Western blot结果显示，与Flag相比，过表达Flag－Notch3（WT），使 A10细胞中Beclin 1表达上调且LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值增高；与Flag－Notch3（WT）相比，过表达Flag－Notch3（R90C）使 A10细胞中Beclin1表达明显下调且LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值降低。如图1所示。

图1 Western blot检测A10细胞内源性Becline 1蛋白及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的表达

2.2 MDC染色检测SH－SY5Y细胞中自噬空泡的变化在A10细胞内过表达Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C），MDC染色结果显示，与 Flag－Notch3（WT）相比，过表达Flag－Notch3（R90C）导致 MDC染色信号减弱，自噬空泡聚集减少。结果如图2所示。

图2 MDC染色检测SH－SY5Y细胞中自噬空泡的变化（免疫荧光 ×400）

2.3 PI／Annexin－V－FITC检测Notch3（R90C）对细胞凋亡率的影响PI／Annexin－V－FITC检测细胞凋亡率，结果显示，与Flag－Notch3（WT）相比，过表达Flag－Notch3（R90C）增加细胞凋亡率。如图3所示。

图3 PI／Annexin V－FITC检测细胞凋亡率的变化

3 讨论

Notch3基因是CADASIL的致病基因，编码含有2321个氨基酸的跨膜受体蛋白。Notch3基因在正常组织中主要表达于血管平滑肌细胞。Notch3基因致病性突变导致EGF序列半胱氨酸残基产生，破坏了原有的二硫键配对，导致血管平滑肌细胞功能异常而致病［6］。Joutel等人研究发现在CADASIL病人的组织中，Notch3蛋白胞膜外区域无法正常降解，在血管平滑肌表面积聚；并推测这可能是Notch3蛋白突变体的致病机制［7］。

自噬是细胞内的大分子营养物质和细胞器在溶酶体内降解的过程［8］。自噬过程可分为微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬。在巨自噬形成过程中，LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值明显增高。Beclin 1通过与Vps34结合激活P13K通过促进自噬体的形成，能够反映体内巨自噬的激活水平［9］。细胞内环境紊乱时，细胞自噬被抑制，导致蛋白降解障碍，在细胞内聚集而致病［10］。

本研究发现Notch3（R90C）通过下调A10细胞中Beclin 1蛋白及LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值，抑制自噬水平，促进细胞凋亡。由此我们认为，Notch3（R90C）通过抑制血管平滑肌细胞自噬诱导神经元细胞凋亡；调控自噬可能成为CADASIL治疗一个新的方向。

［1］Fukutake T.Carasil［J］.Brain Nerve，2011，63（2）：99－108.

［2］Uchino M，Rinsho Shinkeigaku.The pathomechanism and treatment of CADASIL［J］.2011，51（11）：945－948.

［3］Tournier Lasserve E，Joutel A，Melki J，et al.Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy maps to chromosome 19q12［J］.Nat Genet，1993，3：256－259.

［4］Utku U，Celik Y，Uyguner O，et al.CADASIL syndrome in a large Turkish kindred caused by the R90Cmutation in the Notch3receptor［J］.Eur J Neurol，2002，9（1）：23－28.

［5］Tikka S，Mykknen K，Ruchoux MM，et al.Congruence between NOTCH3mutations and GOM in 131CADASIL patients［J］.Brain，2009，132（4）：933－939.

［6］Monet－LeprStre M，Bardot B，Lemaire B，et al.Distinct phenotypic and functional features of CADASlL mutations in the Notch3ligand binding domain［J］.Brain，2009，132：1 601－1 612.

［7］Ishiko A，Shimizu A，Nagata E，et al.Notch3ectodomain is a major component of granular osmiophilic material（GOM）in CADASIL［J］.Acta Neuropathol，2006，1（12）：333－339.

［8］Ouyang L，Shi Z，Zhao S，et al.Programmed cell death pathways in cancer：a review of apoptosis，autophagy and programmed necrosis［J］.Cell Prolif，2012，45（6）：487－498.

［9］Kubli DA，Gustafsson B.Mitochondria and mitophagy：the yin and yang of cell death control［J］.Circ Res，2012，111（9）：1 208－1 221.

［10］Rubinsztein DC，Codogno P，Levine B.Autophagy modulation as a potential therapeutic target for diverse diseases［J］.Nat Rev Drug Discov，2012，11（9）：709－730.