人趋化因子诱骗受体D6基因真核表达载体的构建及鉴定

李 强，赵良中，陈 爽，李文彬，李 妍 (吉林医药学院病原生物学教研室，吉林吉林 132013)

趋化因子(chemokine)在机体炎症、血管生成、控制细胞增殖、胚胎的发生和发展中发挥重要作用，而趋化因子功能则依赖于分布在不同细胞上相应的趋化因子受体的功能，通常情况下趋化因子与相应受体的结合可以诱发细胞的活化和趋化作用。经典的趋化因子受体均为G蛋白偶联七次跨膜受体，趋化因子与受体结合后，激活了胞浆内偶联的G蛋白信号转导途径，引起细胞内钙离子的变化及细胞的最终活化［1-2］。趋化因子诱骗受体D6是一种炎性CC趋化因子的结合蛋白，能广泛结合炎性CC趋化因子，这种结合作用与经典的趋化因子受体相似，同时D6在序列和结构上也与经典趋化因子受体相似。但与经典趋化因子受体不同的是，D6与趋化因子结合后，不能传递信号，无法趋化和活化靶细胞，反而对趋化因子有内化和清除的作用，因此也称为清除受体［3］。D6对炎性CC趋化因子的清除作用在各种炎性疾病的发展、预后等方面发挥重要的作用，也与肿瘤的发生密切相关［4］。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人D6基因重组质粒pCMV6-AC-hD6购自北京Origene公司;质粒pCDNA3.1-myc-HisA和JM109感受态细胞为深圳百恩维生物科技有限公司产品;小量质粒抽提试剂盒及Trans2K Plus II DNA Marker为北京全式金生物公司产品;DNA引物合成及基因测序由美国invitrogen公司完成;限制性内切酶HindⅢ、AgeⅠ和T4 DNA Ligase为美国NEB公司产品。

1.2 PCR扩增目的基因

根据目的基因两端序列设计引物，在载体pCDNA3.1-myc-HisA多克隆位点上选择HindⅢ和AgeⅠ两个酶切位点，设计引物时在引物两端引入上述两个酶切位点，两端引物分别为HindIII-F:5'-CCCAAGCT TCACCATGGCCGCCACTGCCTCTCCGCAGCC-3' 和AgeI-R:5'-CGGACCGGTGGCTGATTTATTCCCCACAT CCTCCTTGTTA-3'。PCR 反应体系为:在50 μL的总反应体系中加入5× Fast pfu buffer 10 μL，dNTP Mix(2.5 mol/L)4 μL，正向引物(10 μmol/L)2 μL，反向引物(10 μmol/L)2 μL，Fast pfu polymerase 1 μL，模板 DNA(100 mg/L)1 μL，dd H2O 22 μL。反应条件如下:95℃预变性3 min，95℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸 30 s，反应 30个循环，72℃ 延伸5 min。低溶点凝胶电泳分离目的基因，以琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收目的基因。

1.3 载体及目的基因的双酶切

以限制性内切酶HindⅢ和AgeⅠ分别对pCDNA3.1-myc-HisA载体和目的基因双酶切，酶切反应在37℃水浴反应2 h，pCDNA3.1-myc-HisA载体的酶切反应体系为:1 μg的质粒pCDNA3.1-myc-HisA，2 μL 的 10 × Buffer，2 μL 的 10 × BSA，1 μL 的 HindⅢ，1 μL的AgeⅠ，最后以dd H2O补足反应体系至20 μL。目的基因的酶切反应体系为:14 μL的PCR回收产物，2 μL 的10 ×Buffer，2 μL 的10 ×BSA，1 μL的 HindⅢ，1 μL 的 AgeⅠ，总反应体系为 20 μL。

1.4 载体与目的基因的连接和转化

回收并纯化酶切产物，并进行连接反应。反应条件为22℃反应2 h，反应体系为:6 μL目的基因，2 μL载体 DNA，2 μL 的 10 × Buffer，1 μL 的 T4DNA连接酶。取10 μL连接产物与100 μL的JM109感受态细菌混匀后冰浴30 min，42℃热激45 s，立即置冰上放置2 min，加入预热至室温的400 μL LB培养基，37℃恒温摇床培养1 h，4 000 r/min离心1 min，弃去400 μL培养上清，剩余100 μL用移液器混匀后均匀涂布于含100 mg/L的Ampicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

1.5 目的基因的鉴定及测序

挑取4～6个单菌落接种于含5 mL，100 mg/L的Ampicillin抗性的LB培养液中，250 r/min，37℃恒温摇床培养过夜，提取质粒，用HindⅢ和AgeⅠ做酶切鉴定，鉴定正确的重组克隆进行测序验证。

2 结果

PCR法从质粒pCMV6-AC-hD6上扩增D6基因，获得D6基因的PCR产物，经电泳检测后在1 000 bp处可见电泳条带，与目的基因1 155 bp相符。纯化回收后，与载体质粒pCDNA3.1-myc-HisA分别进行双酶切，得到的酶切产物回收纯化并连接，连接产物转化JM109感受态细菌，Amp抗性筛选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切，在1 000 bp处见酶切片段条带(图1)。选取阳性结果进行测序，构建的真核表达载体pCDNA3.1-hD6-his核苷酸序列正确，并正确插入到表达载体的开放读码框中。

图1 pCDNA3.1-hD6-his酶切鉴定结果

3 讨论

D6作为炎性CC趋化因子清除受体，可清除炎性趋化因子，因此在控制和调节免疫反应、抑制炎症细胞浸润、促进炎症反应消退［5-7］等方面发挥重要的作用。目前研究表明，D6可参与皮肤炎症和肿瘤，不但可以控制皮肤炎症反应、炎性趋化因子的清除及炎症消退过程［8-9］，而且对皮肤新生肿瘤的易感性和肿瘤的进展发挥作用［10］;D6可以调节肺部的炎症反应［11］，对肺的抗微生物感染、免疫激活有重要作用，而且在分枝杆菌感染引起的炎症之间的平衡中发挥重要作用［12］;D6在参与肠炎和结肠癌的研究中表明，D6可以提高结肠炎相关的癌症的易感性［13］;D6在急性中毒性肝损伤中可发挥减轻肝损伤作用［14］;D6在胎盘合体滋养层细胞上表达，因此与胎盘免疫与流产密切相关。D6在胎盘屏障局部可减少炎性CC趋化因子的富集，限制母体免疫细胞识别父系同种异体抗原［15］。同时D6的缺陷，可引起CC趋化因子水平增高以及胎盘局部白细胞的浸润，从而导致流产率的增高［16］，此外 D6 在同种异体抑制排斥［17］、自身免疫性疾病的发生和发展［18-19］过程中也发挥作用。实验构建的人D6真核表达载体，可用于人D6在细胞内参与炎症反应机制的研究，也可用于炎症或肿瘤动物模型中D6参与机制的研究，可为人D6在机制和临床疾病治疗靶点方面的研究奠定基础。

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