五子衍宗方对实验性隐睾小鼠复位固定术后生精功能恢复的影响*

曾 晓，袁 丁，王 婷，刘苗苗，狄国杰，张海滨，李 靳，刘朝奇，张长城

(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

隐睾是男性常见的泌尿生殖系统先天畸形，是引起男性不育的主要危险因素之一，临床上以手术治疗为主，但隐睾患者精子质量在隐睾术后仍可能继续受到损害。中医药对改善精子数量和质量及运动功能方面均显示出独特优势，但中药对隐睾复位固定术后睾丸生精功能恢复的影响还少有研究。本实验以经典补肾填精方剂五子衍宗方为研究对象，观察该方对小鼠实验性隐睾复位固定术后睾丸生精功能恢复的影响，从而为临床运用五子衍宗方治疗隐睾复位固定术后睾丸生精功能恢复障碍提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

雄性SPF级Balb/c小鼠5～6周龄，体质量22～25g，由湖北省实验动物中心提供(动物生产许可证号 SCXK(鄂)2008-0005)。

1.2 药物

五子衍宗方组成:枸杞子 400g，菟丝子(炒)400g，覆盆子 200g，五味子(蒸)50g，车前子(盐炒)100g，按照传统方法煎药浓缩干燥至粉末，总提取率为35%，临用前用蒸馏水溶解。

1.3 Bouins液

苦味酸饱和水溶液750 mL，甲醛250 mL，冰醋酸 50 mL。精子营养液:BWW(NaCl 0.554 g·L－1，KCl 0.0356 g·L－1，CaCl20.025 g·L－1，KH2PO40.0162 g·L－1，MgSO4·7H2O 0.0294 g·L－1，NaHCO30.210 g·L－1，NaPyr 0.003 g·L－1，Nalac 0.370 g·L－1，Glucose 0.100 g·L－1，质量分数 0.5% 的酚红1.0mL，青霉素 10000 U，质量分数 0.3%的 BSA)。其余药品均为分析纯。

1.4 仪器

SQIAS-2000彩色精液质量图文分析仪(武汉千屏影像技术有限责任公司)，DMR型多功能显微镜及图像分析系统(德国 Leica公司)，H-7500型透射式电子显微镜(德国 Leica公司)，ULTRACUT R型超薄切片机(奥地利莱卡公司)，JA2003型电子分析天平(上海天平仪器厂)，COULTZEREPICS XL2MCL流式细胞仪，Beckman公司。

2 方法

2.1 隐睾模型制备

32只Balb/c雄性小鼠随机分为4组，依次为假手术组、模型组、五子衍宗方 100、200 mg·kg－1剂量组，每组各8只。各组小鼠用2%戊巴比妥钠80 mg·kg－1麻醉后，腹中线开口，将双侧睾丸提入腹腔，假手术组即关闭切口，其余各组切断韧带，缝合内环口，关闭切口。手术后常规饲养14 d，隐睾所造成的生精功能损害模型即已形成［1］。

2.2 隐睾复位固定手术

隐睾模型建立以后，各组小鼠用2%戊巴比妥钠80 mg·kg－1麻醉，腹中线开口，假手术组即关闭切口，其余各组将内环口的缝线拆除，扩大内环口，用丝线将双侧腹腔中的睾丸固定在阴囊底部，关闭切口。于固定术后第2天给药，假手术组和模型组每天灌服纯净水 0.01mL·g－1，五子衍宗方 100、200 mg·kg－1组分别每天灌服相应剂量五子衍宗方(对应五子衍宗方生药含量分别为 285，570 mg·kg－1)，每天1次，各组小鼠连续给药14 d。

2.3 小鼠生殖器官质量测定

末次给药24 h后称重，处死小鼠取睾丸和附睾并称湿重。

2.4 小鼠精子密度及精子活率的测定

将盛有6 mL精子营养液［3］的试管置于恒温水浴箱预热至37℃，取单侧附睾去除脂肪，剪碎放入试管中摇匀，37℃保温10～15 min，使精子充分游离，接着取1滴滴入牛鲍氏血细胞计数板上，计算每1mL精子数。用微量移液器吸取10 μL精子悬液，利用SQIAS-2000彩色精液质量图文分析仪进行精子活率测定。

2.5 小鼠睾丸组织形态学及超微结构观察

取单侧睾丸，石蜡切片(4 μm厚)，HE染色，光镜观察睾丸组织内精原细胞与各级生精细胞的分布情况。环氧树脂包埋做超微切片，电镜观察睾丸组织内曲细精管及各级生精细胞超微结构的变化。

2.6 小鼠睾丸各倍体生精细胞比例影响测定

取单侧睾丸去除包膜、剪碎，置于3ml pH 7.4的PBS试管中，吹打100次，自然沉淀5min弃上清，1mg·ml－1胰酶 1 ml、37℃ 消化 20 min，用 200 目尼龙网过滤，取细胞液 1000 r·min－1离心 5 min，弃上清，加 3 ml PBS 将沉淀悬浮，1000 r·min－1离心 5 min，弃上清，同样条件重复洗涤2次，制成单细胞悬液。PBS 调整细胞浓度至 106～107个·ml－1，4℃ 、70% 乙醇固定12 h后，低速短时离心去除固定液，PBS洗2遍，加 40 μg·ml－1的 RNA 酶 400 μL，于 37℃ 水浴 30 min，加入 100 μL PI染液混匀，4℃避光染色 30 min即可上机进行检测，计算出不同倍体细胞的百分比。

3 结果

3.1 对隐睾小鼠复位固定术后脏器指数影响

表1显示，模型组小鼠睾丸质量显著低于假手术组，五子衍宗方各剂量均可增加生精障碍小鼠的睾丸质量。

表1 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后睾丸质量的影响(±s，n=8)

表1 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后睾丸质量的影响(±s，n=8)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

组别 体质量(g)睾丸质量(mg)睾丸指数(mg·100g － 1)31.6±2.54 93.3±8.32 287.44±25.26模 型 组 31.6±1.66 49.7±2.98＊＊ 154.43±16.84＊＊五子衍宗方100 mg·kg－1组假手术组29.2±2.76 55.4±2.75## 181.36±27.98五子衍宗方200 mg·kg－1组29.6±1.29 62.1±3.03## 185.08±22.08#

3.2 对隐睾小鼠复位固定术后精子密度及精子活率的影响

表2显示，模型组小鼠精子密度、精子活率显著低于假手术组。五子衍宗方各剂量均可显著提升生精障碍小鼠的精子密度和精子活率，且表现出剂量依赖关系。

3.3 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后睾丸组织形态学的影响

光镜可见，阴囊睾丸中精子发生正常，曲细精管形态正常(图1-A)。隐睾小鼠行复位固定手术后，部分曲细精管(“”所示)内细胞增殖明显，填充整个管腔;部分曲细精管内(“”所示)仅保留支持细胞及少量精原细胞，几乎未见精母细胞(图1-B)。五子衍宗方100mg·kg－1剂量给药14 d后，生精上皮结构基本完整，可见多数小管内精子细胞(图1-C)。五子衍宗方200mg·kg－1剂量给药14 d后，生精细胞的有序排列基本不变，部分曲细精管内有正常的精子发生过程(“”所示)(图1-D)。

表2 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后精子计数和活率的影响(±s，n=8)

表2 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后精子计数和活率的影响(±s，n=8)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

组别 精子计数/×108·L－1 精子活率/%假 手 术 组34.54±3.60 42.20±9.18模型组 11.46 ±1.80＊＊ 6.40 ±1.52＊＊五子衍宗方100mg·kg－1组 20.68±0.84## 20.80±1.92##五子衍宗方200mg·kg－1组 22.84±2.06## 31.20±2.39##

图1 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后睾丸组织形态学的影响(HE×200)

3.4 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后睾丸组织超微结构的影响

电镜下可见，阴囊睾丸中可见形态正常的精子细胞，精子发生正常(图2-A，8K)。隐睾小鼠行复位固定手术后，可见精子细胞胞核皱缩，核周线粒体脊受损(“”所示)，部分线粒体内空泡(图2-B，8K)。五子衍宗方给药14 d后，可见精母细胞处于活跃的增殖期，核染色变深，胞质内线粒体空泡明显减少(图 2-C、D，7K)。

3.5 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后睾丸各级生精细胞比例的影响

表3显示，与假手术组比较，模型组小鼠1N和4N细胞百分比显著下降，2N细胞百分比相应升高。五子衍宗方各剂量均可显著增加小鼠睾丸内1N和4N细胞的百分比，而2N细胞比例相对下降。

4 讨论

我们前期研究显示［2］，小鼠进行隐睾造模后可致睾丸内生精细胞发生退化，生精上皮变薄，生精功能明显降低。本实验在前期研究基础上，模拟临床手术治疗方式，将隐睾回纳入阴囊并固定于阴囊底部，于术后给予五子衍宗方，以探讨隐睾复位固定术后五子衍宗方对睾丸生精功能恢复作用的影响。

图2 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后睾丸组织超微结构的影响

表3 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后睾丸各级生精细胞比例的影响(±s，n=8)

表3 五子衍宗方对隐睾小鼠复位固定术后睾丸各级生精细胞比例的影响(±s，n=8)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

组别29.77±2.85 26.07±3.15 23.73±1.25模 型 组 0.63±0.10＊＊ 59.50±4.29＊＊ 15.83±3.06*五子衍宗方100 mg·kg－1组 6.44±1.17## 44.67±2.55## 21.37±0.67#五子衍宗方200 mg·kg－1组 9.11±0.68## 42.17±4.99# 32.37±2.03 1N/% 2N/% 4N/%假手术组##

精子在睾丸中发生，经由精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞而成形，精子的数量和活率是评价精液质量的重要指标，是影响受孕的重要因素。本研究发现，小鼠隐睾进行睾丸复位固定手术后，睾丸重量、精子密度、精子活率等显著下降，其生精上皮呈现部分过度增殖而使管腔阻塞，部分不能增殖而使生精小管退化萎缩。流式结果显示，初级精母细胞(4N)与精子细胞和精子(1N)比例显著降低。五子衍宗方能够增加模型小鼠的睾丸重量，提高精子密度与精子活率，恢复生精小管内生精上皮结构，促进精原细胞、初级精母细胞的进一步分化，并促进次级精母细胞向精子细胞的转化，从而恢复睾丸内各级生精细胞百分比。本实验的研究对于隐睾复位固定术后促进睾丸生精功能恢复的辅助用药具有现实的指导意义。

［1］曾晓，张长城，狄国杰，等.五子衍宗方对实验性隐睾小鼠生精功能的保护作用［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(24):170-173.