白藜芦醇对糖尿病性白内障大鼠晶状体中P53表达的影响

帅天姣，张 剑，张 涤，王冬兰

(佳木斯大学附属第一医院眼科，黑龙江佳木斯154003)

随着生活水平和质量的提高，糖尿病以渐入国人的生活，其并发症常常困扰着国人的健康，其眼科并发症越来越受重视[1]。糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)是糖尿病眼病的主要并发症之一，是导致成人致盲的原因之一，其发病机制复杂，晶状体上皮细胞(lens epithelial cell，LEC)凋亡在疾病发展过程中发挥重要作用[2]，同时，氧化性损伤也是重要成因[3]。白藜芦醇是一类非黄酮类多酚化合物，具有强大抗氧化、清除氧自由基以及抗凋亡能力[4]。本实验旨在研究白藜芦醇对STZ(链脲佐菌素)诱导糖尿病性白内障大鼠LEC有无作用及对其晶状体中P53表达的影响，并探讨其可能的作用机制，以期为临床治疗提供更科学的依据。

1 材料和方法

1.1 实验药品与试剂

白藜芦醇和STZ均购自Sigma公司(纯度分别＞99%和＞98%)，P53一抗、二抗及显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司，PBS缓冲液、梯度酒精、4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液、二甲苯、防脱剂等生化试剂均自上海生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组与处理:Wistar大鼠80只(由长春亿斯动物实验中心提供)，雌雄各半，2月龄，体质量(160±20)g，经散瞳实验检查结果显示晶状体均正常透明，随机分为4组:A正常对照组、B糖尿病模型组、C白藜芦醇低剂量治疗组及D白藜芦醇高剂量治疗组，每组各20只，适应性喂养1w后，糖尿病模型组在禁食8h后一次性腹腔注射STZ(溶于新鲜配制的 0.1mol/L的柠檬酸缓冲液，pH 4.5)60mg·kg－1，正常对照组以等量柠檬酸缓冲液腹腔注射，72h后鼠尾静脉采血测定空腹血糖，以血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病模型组。白藜芦醇高剂量治疗组及白藜芦醇低剂量治疗组在糖尿病模型组基础上每日固定时间分别以白藜芦醇混悬液100mg·kg－1·d－1、20mg·kg－1·d－1体质量灌胃，正常对照组及糖尿病模型组均给予含0.02mL/mL DMSO的生理盐水灌胃，分别于4w、8w、12w裂隙灯下观察各组大鼠晶状体混浊程度并予以记录，并于末次给药后次日采用10%水合氯醛麻醉并在无菌条件下处死大鼠，4℃ 取晶状体，采用石蜡包埋组织化学技术，对各组切片行P53免疫组织化学染色，光学显微镜下观察其在4组晶状体中的表达情况。

1.2.2 晶状体混浊程度的观察:大鼠经1%托品卡胺滴眼液滴双眼一次，5min后使大鼠吸入乙醚蒸汽麻醉，裂隙灯下观察各组大鼠晶状体变化情况。晶状体混浊程度根据参考文献[5]标准进行分级:I级，无混浊，晶状体清亮透明;II级，轻度混浊，晶状体周边有少量空泡;III中度混浊，空泡扩散至中心区域，晶状体核出现雾状混浊;IV级，晶状体高度混浊，周边空泡扩展到核区，核雾状混浊进一步加重;V级，核混浊，完全性白内障。

1.3 检测方法

免疫组织化学SP法测定大鼠LEC中P53蛋白的表达，各组晶状体取出后放入10%甲醛溶液中，4℃冰箱固定24～48h，常规石蜡包埋，连续切片，染色，DAB显色，轻度复染，常规封片。

1.4 结果判定

P53阳性细胞为胞浆呈棕黄色，表达结果以高倍镜下每张切片随机选择5个高倍视野，计数50个细胞，计阳性细胞数及阳性率，按切片中阳性细胞数百分比例划为4个等级[6]:0%～5%:(—);5%～10%:(+);20%～35%(⧺);35%～50%(⧻)。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 晶状体混浊度观察

12w后正常对照组大鼠晶状体清亮透明;糖尿病模型组大鼠晶状体 I级、II级、III级、IV级和 V级改变分别为3.0%、17.0%、53.0%、13.7%和 10.0%;白藜芦醇低剂量组大鼠晶状体 I级、II级、III级、IV级和 V级改变分别为47.3%、38.2%、14.5%、0% 和 0%;白藜芦醇高剂量组大鼠晶状体I级、II级、III级、IV级和V级改变分别为65.6%、20.3%、14.1%、0.0%和 0.0%，经统计学分析，糖尿病组大鼠晶状体混浊度分别与白藜芦醇高、低剂量治疗组大鼠晶状体混浊度差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 白藜芦醇对P53的影响

免疫组织化学染色示，P53在正常晶状体上皮细胞中几乎无蛋白表达，其阳性细胞表达率＜0.01%(图1)，P53在糖尿病性白内障晶状体中蛋白高表达(图2)，在白藜芦醇低剂量治疗组(图3)中表达高于白藜芦醇高剂量组治疗组(图4)，见表1。

表1 各组LEC中P53蛋白表达阳性细胞百分率(±s，%，n=6)

表1 各组LEC中P53蛋白表达阳性细胞百分率(±s，%，n=6)

组别4w 8w 12w A ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 B 26.65±0.47 28.87±0.21 30.64±0.91 C 25.16±0.23 23.28±0.46 21.11±0.31 D 24.93±0.22 18.10±0.17 13.35±0.32

图1 P53在A组晶状体上皮细胞的表达(12w)

图2 P53在B组晶状体上皮细胞的表达(12w)

图4 P53在D组晶状体上皮细胞的表达(12w)

LEC中P53蛋白表达分析结果:正常对照组＜0.01%;P53蛋白表达在糖尿病模型组中高于白藜芦醇治疗组，其具有统计学意义(P＜0.05);4w时白藜芦醇高、低剂量治疗组二者之间无统计学意义(P＞0.05)，说明白藜芦醇在用药4w时未起到治疗作用，8w时其二者差异具有统计学意义(P＜0.05)，但差异不显著，12w时二者差异具有统计学意义(P＜0.05)，差异显著，说明白藜芦醇在治疗12w后开始出现明显疗效，且高剂量治疗效果显著大于低剂量治疗效果。

3 讨论

糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)是糖尿病眼病的主要并发症之一，也是导致成人致盲的原因之一，其发病机制复杂。近年来研究者开始在基因层面应用转基因技术探讨与研究糖尿病性白内障多元醇通路与氧化应力二者的关系[7]，以说明氧化损伤与晶状体抗氧化防御系统的紊乱在糖尿病性白内障发生和进展中起着重要作用，对慢性糖尿病白内障的发展至关重要。正常晶状体上皮细胞内几乎无凋亡细胞，而白内障晶状体上皮细胞中可见大量的凋亡细胞，因此其细胞的凋亡可能是各种非先天性白内障发生与发展的共同细胞学基础。细胞凋亡是指基因控制下的细胞死亡，研究发现，现有20余种基因与其有关[8]，按基因表达产物对凋亡过程的作用分为两类，一类是促进凋亡的基因，如P53、Bcl－xs等，另一类是抑制凋亡的基因，如NF－KB、Bcl－2等。本实验中我们也发现糖尿病模型组大鼠LEC凋亡率明显高于正常对照组，再次证实了糖尿病性白内障大鼠LEC凋亡是引起白内障的重要因素。而白藜芦醇处理的大鼠，LEC凋亡率明显低于糖尿病模型组，说明了白藜芦醇在一定程度上抑制或延缓了晶状体上皮细胞凋亡的发生。P53是一种抑癌基因，其有野生型和突变型两类，如果细胞DNA修复失败，P53蛋白持续升高，便可引起细胞凋亡。本实验在正常晶状体中未见P53蛋白表达，在糖尿病模型组中可见阳性细胞，揭示了P53基因促进了LEC的凋亡，导致了晶状体的混浊。本实验通过免疫组织化学法观察大鼠LEC，证实了当有危险因素存在时，可导致LEC的氧化损伤，而使其DNA收到损伤，激活P53基因，导致LEC出现凋亡，最终会晶状体混浊。同时通过观察白藜芦醇的治疗后的大鼠LEC，得出白藜芦醇对糖尿病性白内障大鼠LEC的凋亡有一定的抑制作用，且其高剂量治疗效果明显优于低剂量治疗效果，从而进一步证明白藜芦醇能在一定程度上抑制或延缓了糖尿病性白内障的发生。

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