齐墩果酸对白血病HL－60细胞PI3K、Akt、Cav－1表达的影响

王迪迪，马 微，葛堂栋，王明富，张鹏霞

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007;2.牡丹江医院，黑龙江牡丹江157011)

白血病的治疗一直以化疗和骨髓移植为主，虽然近30年来急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的治疗的取得了长足的进步，但仍然有20%以上的患者难以达到完全缓解，而且大多数完全缓解的患者最终还会复发和死亡。因此，更深入的探索AML发病的分子机制和治疗靶点是当前学者们关注的焦点。现阶段，抗肿瘤药物的研发趋势已经开始从传统的细胞毒药物转向针对细胞内异常信号转导的药物。目前研究表明，在慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中均可检测到PI3K/Akt信号通路的异常活化[1]。本课题旨在探讨

齐墩果酸(oleanic acid，OA)对白血病HL－60细胞PI3K、Akt和Cav－1的mRNA表达以及细胞形态的影响，进一步明确OA治疗白血病的靶点，为抗白血病天然药物的开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

①主要试剂:RPMI－1640培养基购自Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司;齐墩果酸标准品购自中国药品生物制品检定所;RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)、RT－PCR试剂盒及DL2000 Marker购自TaKaRa公司，MTT试剂盒购自Sigma公司，其余试剂为国产分析纯。引物由TaKaRa公司合成，序列见表1。

表1 各引物序列

②药品的配制:称取36.5386mg的OA标准品(购自中国药品生物制品检定所)，溶于1.0mL的DMSO中，制成800μmol/L的贮存液备用。

1.2 方法

①细胞培养及分组:急性早幼粒细胞白血病系HL－60细胞株购自中科院上海生命科学研究院。用含10%胎牛血清RPMI－1640培养基，37℃，5%CO2培养箱中常规培养，每2～3天传代一次。细胞分为加入DMSO的阴性对照组和经80μmol/L OA处理HL－60细胞48 h的OA组。

②细胞的形态学观察:经4%戊二醛前固定，清洗后用1%饿酸后固定，常规脱水、浸透、环氧树脂包埋制成树脂块，用LKBV型超薄切片机切片，铀铅双染，作透射电镜观察。

③RT－PCR检测PI3K、Akt的mRNA表达:按试剂盒说明书操作。

④Westem blot检测CAV－1蛋白水平:制备HL－60细胞蛋白样品后采用BCA法检测蛋白浓度(按试剂说明操作)，检测蛋白表达[1]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，实验所得数据以±s表示，组间比较采用q检验，指标之间的关系采用相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 透射电镜观察

电镜下活细胞计数，OA组与对照组活细胞数相比明显减少(比值为0.3754±0.0913，P ＜ 0.01)，平均抑制率为62.46%。电镜观察空白对照组细胞核完整且核质比例增大、核染色质分布均匀、细胞器结构完整;OA组呈现细胞间连接消失、核固缩且异形性明显、核染色质边集形成新月状贴近核膜、内质网扩张呈空泡化、线粒体嵴模糊或消失、有凋亡小体形成。见图1。

图1 透射电镜观察OA作用后HL－60细胞的形态(×8000)

2.2 OA对HL－60细胞PI3K、Akt、Cav－1 mRNA表达的影响

2.2.1 OA对HL－60细胞PI3K mRNA表达的影响

OA处理组PI3K mRNA表达的相对强度为(0.5805±0.0191)，显著低于阴性对照组(0.8615±0.0162)，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 OA对HL－60细胞PI3K、Akt、Cav－1mRNA表达的影响(±s)

表1 OA对HL－60细胞PI3K、Akt、Cav－1mRNA表达的影响(±s)

组 别 PI3K/β －actin Akt/β －actin Cav－1/β －actin OA 0.5805±0.0191 0.6789±0.0282 0.7583±0.0112 DMSO 0.8615±0.0162 0.8832±0.0135 0.5701±0.0163

2.2.2 OA对HL－60细胞Akt基因表达的影响

OA处理组Akt mRNA表达的相对强度为(0.6789±0.0282)，显著低于阴性对照组(0.8832±0.0135)，有统计学意义(P ＜0.05)，见表1。

3 讨论

白血病是一种严重危害人类健康的造血系统恶性肿瘤[2]，其病因和发病机制与多种遗传学改变密切相关。细胞增殖或凋亡信号转导通路中的某一环节异常，可使细胞增殖调节失控和/或对凋亡发生抵抗而引起细胞生长失控，最终导致肿瘤形成[3]。PI3K/AKT信号通路激活可抑制多种刺激引发的细胞凋亡、促进细胞周期进展、促进细胞生存和增殖、参与血管形成和肿瘤的转移，在恶性肿瘤演变过程中扮演着重要角色。在细胞静息状态下，PI3K普遍存在胞浆中，具有酪氨酸蛋白活性的膜受体(如EGFR)和非受体型蛋白激酶(如Src)可激活Ⅰ型PI3K。生长因子与相应的酪氨酸激酶受体结合后，激活PI3K的催化亚基p110α，后者能催化PIP2肌糖环上D3位点，转化为第二信使PIP3。PIP3形成“锚”结构可与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结合，转位到细胞膜。因此，PIP3能与AKT的PH结构域结合，引起胞浆中AKT向细胞膜转位，继而被细胞膜上的PI3K依赖性激酶1(PDK1)磷酸化其催化区的苏氨酸308位点，而另一个未知的PI3K依赖激酶2(PDK2)则使丝氨酸473位点磷酸化，这两个位点同时磷酸化是AKT激活的必要条件[4]。AKT是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶，其下游有众多的靶分子，激活的AKT从细胞膜脱离，进入细胞浆或细胞核内，激活或抑制下游靶蛋白，在转录和翻译两个水平同时对其靶基因的表达进行调节，从而在生理条件下产生抗凋亡、促增殖的活性[5，6]。Xu 等[7]研究发现，AML 细胞与正常细胞相比，存在着AKT激酶持续活化，经过PI3K抑制剂处理后其生存率降低明显。Kubota等[8]实验证明，半数以上AML患者标本存在PI3K的持续性活化。一方面，PI3K/AKT通路中信号转导分子的活性异常可使下游凋亡通路受阻、加快细胞周期进程，促进正常细胞向肿瘤细胞转化[9];另一方面 PI3K/AKT通路可能会因为受到上游各种受体－配体结合效应的调控和某些信号分子活性的影响，异常激活PI3K/AKT通路，而促进正常细胞向肿瘤细胞转化[10]。研究表明，AKT的活化与白血病的发生发展密切相关[11]。前期实验研究发现，80μM OA 作用 HL－60细胞48h抑制效果最佳[12～14]。此次研究以80μM OA作用HL－60细胞48h后发现HL－60细胞的PI3K、Akt和Cav－1 mRNA表达降低，形态学观察发现OA作用后的HL－60细胞出现细胞凋亡现象，细胞抑制率增加，提示OA可能通过抑制PI3K/AKT信号通路转导促进HL－60细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。

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