依帕司他治疗糖尿病周围神经病变大鼠的疗效评价

邬 磊,刘鹏鹰

(广东省深圳市第二人民医院综合科,广东深圳,518035)

糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病常见的慢性并发症之一,病变可累及全身运动神经、感觉神经及自主神经等系统,且难以逆转[1-2]。依帕司他是一种新型的醛糖还原酶抑制剂,研究[3-5]表明其可以减轻糖尿病大鼠神经纤维的渗出、水肿,亦有报道[6]称其可以缩短糖尿病患者正中神经和胫神经运动纤维最小F波潜伏期。本研究采用链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,而后给予依帕司他治疗并评价其疗效,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD雄性大鼠80只,8周龄,体质量170～220 g(浙江大学医学院实验动物中心提供)。试剂:链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司,批号S-0130);依帕司他(中国扬子江药业集团,批号国药准字H20040012);cAMP、cGMP放射免疫分析试剂盒(上海中医药大学同位素室,批号200710);超微量ATP酶测试盒(南京建成生物工程研究所,批号 20090516);还原型辅酶Ⅱ(NADPH)测试盒(北京恒奥生物科技有限公司,批号10621692001)。仪器:Neuromatic 2000M/C肌电图机(丹迪公司);VC-10双道记忆示波器(日本光电公司);Bionime Rightest GM300血糖仪;MPF-4型荧光分光光度计(日立公司);SN-697型放射免疫γ计数器(上海核所日环光电仪器有限公司)。

1.2 实验方法

在实验室内适应性喂养1周后,禁食不禁水12 h,按体质量层次随机分为正常对照组(n=20)和造模组(n=60)。STZ溶于0.1 mmol/L的枸橼酸钠缓冲液(pH 4.5)中,按60 mg/kg的剂量一次性腹腔注射,72 h后由尾静脉采血测定血糖,以血糖值≥16.7 mmol/L为造模成功的糖尿病大鼠[7]。选取40只造模成功的大鼠并随机分为模型对照组和依帕司他治疗组,每组20只。依帕司他治疗组按100 mg/(kg·d)给药,模型对照组给予生理盐水2 mL/d,连续给药8周。

1.3 观察指标

1.3.1 一般指标监测:采取动态监测的方式,从大鼠糖尿病形成至实验结束(8周),测定体质量,尾静脉取血测定血糖,1次/2周。

1.3.2 坐骨神经传导速度测定[8]:测定坐骨神经传导速度(MNCV),用10%水合氯醛将大鼠麻醉,俯卧位固定,刺激电极置于坐骨结节处坐骨神经传出部位,记录电极置于踝关节坐骨神经经过处,用2个针电极经皮插入,电极间距为2 mm,接地于尾部,用方形波(10～ 20 mA,40 μ s脉波宽)刺激神经,用2个针电极在同侧的足部骨间肌记录复合肌肉动作电位。记录3对不同的M波潜伏期,取其平均值。近端和远端的潜伏期差值作为运动神经在2个刺激部位间的传导时间,再测量出2个刺激部位间的距离。MNCV=刺激电极与记录电极间的距离/潜伏期差值。

1.3.3 感觉神经传导速度测定:测定感觉神经传导速度(SNCV),用10%水合氯醛将大鼠麻醉,俯卧位固定,刺激电极置于坐骨结节处坐骨神经传出部位,记录电极置于踝关节坐骨神经经过处,用2个针电极经皮插入,电极间距为2 mm接地于尾部,用方形波(2 mA,40 μ s脉波宽)记录6对坐骨窝和踝激发的H反射潜伏期,取最短的潜伏期差值,再测量出2个刺激部位间的距离。SNCV=刺激电极与记录电极间的距离/潜伏期差值。

1.3.4 坐骨神经中醛糖还原酶(AR)活性、Na+-K+-ATP酶活性测定[9]:取大鼠坐骨神经,冷生理盐水冲洗、称重后,加入1.5 mL的冷生理盐水匀浆,匀浆液0℃～4℃条件下3 500 r/min离心15 min,所得上清液以荧光分光光度法进行AR活性测定。Na+-K+-ATP酶活性测定采用超微量ATP酶测试盒,严格依照说明书进行操作。

1.3.5 坐骨神经中 cAMP、cGMP含量的测定[10]:将大鼠麻醉成功后,分离出坐骨神经,在冰浴环境中将坐骨神经放入盛有2mL冷的0.05 mmoL醋酸缓冲液(pH 4.75)的匀浆器内,组织粉碎后将悬浮液倒入10mL试管内,用2 mL无水乙醇洗匀浆器,然后将乙醇倒入悬浮液中混匀并静置5 min,3 000 r/min离心15 min后,将上清液收集在小瓶内。用2 mL 75%乙醇洗匀浆器和沉淀2次,混匀3000 r/min离心15 min后,合并上清液,60℃水浴中吹干,残渣4℃保存。用1 mL醋酸缓冲液溶解残渣 ,取0.1 mL样本与乙酸化试剂5 IU,125I cAMP标准或者125I cGMP标准100 IU,抗血清100 IU混匀,4℃存放过夜后,再向其中加入正常兔血清100 IU。羊抗兔血清100 IU,混匀,4℃存放过夜。3 000 r/min离心15 min后,负压吸去上清液,再用SN-697型放射免疫γ计数器进行测定。

2 结 果

2.1 各组大鼠体质量及血糖变化比较

造模前各组大鼠体质量、血糖无显著差异(P>0.05);造模后2、8周,模型对照组及依帕司他组大鼠体质量明显低于正常对照组(P<0.01),血糖则显著高于正常对照组(P<0.01);依帕司他组治疗前后血糖无明显降低(P>0.05)。见表1。

2.2 3组大鼠坐骨神经MNCV、SNCV变化比较

实验进行2、8周后,模型对照组大鼠坐骨神经MNCV、SNCV较正常对照组明显减慢(P<0.01),依帕司他组MNCV、SNCV则有显著提高。见表2。

2.3 3组大鼠坐骨神经AR活性、Na+-K+-ATP酶活性、cAMP及cGMP含量比较

与正常对照组比较,模型对照组AR活性显著升高(P<0.01),Na+-K+-ATP酶活性显著降低(P<0.01);依帕司他组AR活性较模型对照组显著降低(P<0.01),Na+-K+-ATP酶活性显著升高(P<0.01)。模型对照组坐骨神经中cAMP、cGMP的含量显著低于正常对照组(P<0.01),依帕司他组cAMP、cGMP含量显著高于模型对照组(P<0.05)。见表3。

表1 3组大鼠体质量及血糖变化比较( ±s)

表1 3组大鼠体质量及血糖变化比较( ±s)

与正常对照组比较,＊＊P<0.01。

组别 n体质量/g 2周 8周血糖/(mmol/L)2周 8周正常对照组 20 197.5±8.6 196.8±12.7 9.35±1.36 9.59±1.38模型对照组 20 132.9±7.4＊＊ 130.4± 6.5＊＊ 18.27±1.07＊＊ 18.76±1.02＊＊依帕司他组 20 130.1±8.3＊＊ 129.6± 6.8＊＊ 18.86±1.12＊＊ 19.08±1.04＊＊

表2 3组大鼠坐骨神经MNCV、SNCV变化比较( ±s)cm/s

表2 3组大鼠坐骨神经MNCV、SNCV变化比较( ±s)cm/s

与正常对照组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01;与模型对照组比较,##P<0.01。

组别 n M NCV 2周 8周SNCV 2周 8周正常对照组 20 48.34±1.23 48.89±1.45 40.05±1.23 39.51±1.39模型对照组 20 42.43±2.09＊＊ 42.95±0.99＊＊ 2.15±1.73＊＊ 32.36±2.06＊＊依帕司他组 20 47.46±1.25＊## 48.04±0.97＊## 38.37±1.45＊## 38.31±1.19＊##

表3 3组大鼠坐骨神经AR活性、Na+-K+-ATP酶活性、cAMP、cGMP变化比较( ±s)

表3 3组大鼠坐骨神经AR活性、Na+-K+-ATP酶活性、cAMP、cGMP变化比较( ±s)

与正常对照组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01;与模型对照组比较,#P<0.05,##P<0.01。

组别 n AR活性/(U/mg)Na+-K+-ATP 酶活性/[μ moL/(mg·h)]cAMP cGMP正常对照组 20 9.33±0.83 0.970±0.067 57.21±3.58 47.38±3.22模型对照组 20 11.48±1.66＊＊ 0.804±0.091＊＊ 51.87±3.32＊＊41.67±2.59＊＊依帕司他组 20 10.19±0.81＊＊## 0.905±0.085＊## 54.83±3.52＊#43.96±3.10＊＊#

3 讨 论

目前,DPN的发病机制尚不完全清楚,本研究发现DPN大鼠坐骨神经MNCV、SNCV较正常对照组明显减慢,说明其存在周围神经损害。生理状态下,葡萄糖大部分被己糖激酶磷酸化,通过糖酵解和三羧酸循环为人体提供能量,仅少量非磷酸化葡萄糖进入多元醇代谢通路。AR是多元醇通路的限速酶,能将葡萄糖转化为山梨醇。高血糖状态下,AR则被过度激活,造成细胞内山梨醇和果糖聚积[11-12]。依帕司他是一种新型醛糖还原酶抑制剂,能阻断异常活跃的多元醇旁路,增加细胞外肌醇进入细胞内,从而阻止或减缓糖尿病神经病变[13-14]。本研究发现给予DPN大鼠依帕司他治疗后,其坐骨神经MNCV、SNCV减慢速度较模型对照组更为缓慢(P<0.01),与文献[15]报道符合,说明依帕司他对DPN大鼠坐骨神经损害有治疗作用。

本研究结果显示,依帕司他治疗前后血糖无明显降低(P>0.05),说明其对神经病变的影响并非通过降低血糖而起作用。本研究还发现DPN大鼠坐骨神经AR活性升高(P<0.01),Na+-K+-ATP酶活性降低(P<0.01),而依帕司他治疗后则能降低AR活性(P<0.01),并升高Na+-K+-ATP酶活性(P<0.01),推测其可能的作用机制是:在高血糖状态下,AR活性增强,多元醇旁路激活导致细胞膜Na+-K+-ATP酶活性下降,有可能会导致大鼠坐骨神经的静息电位发生改变。依帕司他能恢复Na+-K+-ATP酶活性,使细胞处于超极化状态,进而使细胞功能得到恢复。

作者还发现DPN大鼠坐骨神经cAMP、cGMP的含量有下降(P<0.01),而依帕司他治疗后cAMP、cGMP含量有升高(P<0.05),推测作为神经传导的第二信使cAMP、cGMP的含量减少会影响神经信号传递,减慢神经传导速度,进而引起神经病变。依帕司他通过增加cAMP、cGMP的含量来改善DPN大鼠周围神经损害,但具体作用机制尚待进一步研究探讨。

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