黄芩茎叶总黄酮对过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用及其机制

曹致超,周晓霞,庞树华,谭家成,苏佩清

(1.扬州大学临床医学院,江苏扬州,225001;2.扬州市中医院,江苏扬州,225002)

黄芩茎叶总黄酮(SSTF)为黄芩茎叶的提取物,其主要成分为黄酮类化合物。药理学研究[1-5]表明,SSTF有降压、抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂等广泛的药理活性。本研究利用细胞培养技术,用过氧化氢(H2O2)构建人脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化损伤模型,观察SSTF对HUVEC氧化损伤的保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与主要试剂

黄芩茎叶总黄酮(由承德医学院中药研究所提供,批号:010408);DMEM培养基(美国Gibco公司产品);小牛血清(山东银香伟业生物有限公司产品);胰蛋白酶(美国Sigma公司产品);MTT(美国Sigma公司产品);Bcl-2,山羊抗小鼠lgGHRP(武汉博士德生物工程有限公司产品);Annexin V-FITC/PI试剂盒(南京凯基生物工程有限公司产品);LDH、MDA、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所产品);其他试剂均为国产分析纯。人脐静脉内皮细胞株购于南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HUVECs的培养:人脐静脉内皮细胞株,复苏后用含有10%小牛血清的DMEM培养液,放入CO2孵箱中培养(37 ℃、5%CO2、95%空气,保持一定湿度),镜下观察细胞生长情况,根据细胞生长情况,给予换液;约 2～3 d,细胞生长汇合成单层,用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶3传代。实验过程中采用生长汇合成单层的内皮细胞。

1.2.2 实验分组:对照组:只加相应体积培养液;H2O2损伤模型组:在培养液中加入 2 mmol/L H2O2诱导损伤4 h;药物保护组:依次为SSTF低浓度组、SSTF中浓度组、SSTF高浓度组。先分别在培养液中加入终浓度为100、200、400mg/L SSTF孵育24 h,再加入2 mmol/L H2O2诱导损伤4 h;维生素C(VitC)阳性对照组:在培养液中先加入终浓度为20mg/LVitC孵育24h,再加入2 mmol/L H2O2诱导损伤4 h。

1.2.3 MTT法检测HUVEC活力:实验结果以MT T(OD)值以及细胞生长抑制率表示。细胞生长抑制率计算公式:(对照组OD-实验组OD)/对照组OD×100%

1.2.4 LDH、SOD和MDA的测定:按实验分组所述方法处理后,收集细胞培养上清液,分别按LDH、MDA、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)中说明书上所述的方法分别检测LDH、SOD的活性和MDA的含量。

1.2.5 细胞凋亡率以及凋亡抑制蛋白Bcl-2的检测:按实验分组所述方法培养和处理细胞,按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书上的操作步骤收集细胞和加试剂处理,最后经流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;同时,收集各组细胞,提取各组细胞中的蛋白样品并且测定蛋白含量,最后采用western-blot法测定各组细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达情况。

2 结 果

2.1 SSTF对氧化损伤HUVEC细胞活力、细胞培养液中LDH活性的影响

H2O2处理HUVEC后其细胞活力较正常组HUVEC细胞活力下降,细胞培养液中LDH活性明显增加(P<0.01);与H2O2组比较,SSTF中、高组细胞活力明显增高(P<0.05或P<0.01),而细胞培养液中LDH活性显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 SSTF对氧化损伤HUVEC细胞活力、培养上清液中LDH活性的影响( ±s)

表1 SSTF对氧化损伤HUVEC细胞活力、培养上清液中LDH活性的影响( ±s)

与H2O2损伤组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01;与对照组比较,##P<0.01。

组别 OD IR/% LDH/(U/L)正常对照组 0.462±0.057 0.0 803.03±21.43 H2O2损伤组 0.264±0.035## 42.9 1212.10±42.85##SSTF低浓度组 0.281±0.021 39.2954.54±21.43＊SSTF中浓度组 0.301±0.029＊ 34.8833.33±107.13＊＊SSTF高浓度组 0.329±0.037＊＊ 28.8560.60±192.85＊＊VitC组 0.297±0.025＊ 35.7954.50±421.43＊

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.2 SSTF对氧化损伤HUVEC培养上清液中SOD活性和MDA含量的影响

H2O2处理HUVEC后,其SOD活性较正常HUVEC组的降低,MDA含量明显升高(P<0.05或P<0.01);与H2O2损伤组比较,SSTF低、中、高组HUVEC细胞培养上清液中SOD活性增高,而MDA含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表 2。

表2 SSTF对氧化损伤HUVEC培养液中SOD活性、MDA含量的影响( ±s)

表2 SSTF对氧化损伤HUVEC培养液中SOD活性、MDA含量的影响( ±s)

与H2O2损伤组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01;与对照组比较,#P<0.05,##P<0.01。

组别 SOD/(U/mL)MDA/(nmol/mL)正常对照组 6.54±0.20 0.44±0.11 H2O2损伤组 5.84±0.15# 0.89±0.11##SSTF低浓度组 6.79±0.40＊＊ 0.63±0.06＊SSTF中浓度组 7.14±0.20＊＊ 0.44±0.00＊＊SSTF高浓度组 7.61±0.02＊＊ 0.34±0.05＊＊VitC组 6.89±0.15＊＊ 0.15±0.00＊＊

2.3 SSTF对氧化损伤HUVEC的凋亡率、凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平的影响

H2O2处理HUVEC后其细胞凋亡率明显增加,Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与H2O2损伤组比较,SSTF高浓度组细胞凋亡率明显下降(P<0.01),SSTF低、中、高组凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平明显增高(P<0.01)。见图1、2及表 3。

图1 SSTF对氧化损伤HUVEC细胞凋亡率的影响

图2 SSTF对氧化损伤HUVEC细胞Bcl-2蛋白表达的影响

表3 SSTF对氧化损伤HUVEC的凋亡率、Bcl-2表达水平的影响( ±s)

表3 SSTF对氧化损伤HUVEC的凋亡率、Bcl-2表达水平的影响( ±s)

与H2O2损伤组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01;与对照组比较,#P<0.05,##P<0.01。

组别 细胞凋亡率/% Bcl-2(IOD)正常对照组 4.35±0.76 797.80±611.71 H2O2损伤组 58.43±2.04## 201.50±225.92#SSTF低浓度组 539.60±158.78＊SSTF中浓度组 603.24±15.78＊SSTF高浓度组 28.78±1.57＊＊ 746.02±37.93＊VitC组 18.90±1.80＊＊ 305.73± 28.94

3 讨 论

血管内皮细胞覆盖于血管内膜表面,直接与循环血液接触,因此很容易受到血液中活性物质,特别是自由基以及脂质过氧化产物的影响。内皮细胞功能损伤是多种血管性疾病发病的关键环节[6]。造成血管内皮细胞损伤的因素有很多,其中氧化应激是造成血管内皮损伤的较为重要的因素之一[7-8],采取抗氧化应激来保护血管内皮细胞功能,是防治血管性疾病的着力点之一。现阶段的抗氧化药物大多为化学合成,其数量和效果非常有限,且存在一定的毒性、致畸性和潜在致癌性。因此,筛选有效、无毒的自由基清除剂来逐渐取代这些化学合成的抗氧化剂具有重大的现实意义。人们先后从植物中提取许多具有清除自由基能力的天然产物,其中黄酮类化合物就是其中活性较强的一类。周晓慧等[11]研究证实SSTF通过清除氧自由基保护O2-损伤的心肌细胞,降低H2O2导致的培养心肌细胞的凋亡率,SSTF对心肌细胞的保护效应可能与其促进Bcl-2蛋白高表达,抑制Bax蛋白的表达从而抑制心肌细胞凋亡有关。SSTF对培养大鼠肝细胞损伤有明显的保护作用,其机制可能与其抗脂质过氧化作用有关[9-12],而关于SSTF对氧化损伤的血管内皮细胞的保护作用及其机制的研究,目前尚未见有报道。

H2O2可直接作用于细胞膜脂质,造成脂质过氧化反应,造成细胞膜的损伤,细胞活力值(MTT法)明显降低,细胞上清液中MDA含量和 LDH活性明显增加,细胞凋亡率明显增加,而SOD活性明显降低。其中MDA含量的高低可以反映脂质过氧化反映的严重程度,细胞活力值的大小、LDH活性的高低是反映细胞受损伤程度的非常灵敏的指标。SOD活性的高低可以反应机体抗氧化反应的能力。

本研究结果显示,SSTF能减轻H2O2对HUVEC的损伤作用,降低细胞上清液中MDA的含量和LDH活性,增加细胞上清液中SOD的活性,降低H2O2导致的培养HUVEC的凋亡率,其机制可能与上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达水平有关。

[1]赵连科,佟继明.黄芩茎叶总黄酮降压作用的实验研究[J].承德医学院学报,1993,10(1):7.

[2]周晓慧,杨鹤梅,马卫军,等.黄芩茎叶总黄酮对培养心肌细胞H2O2损伤超微结构的影响[J].承德医学院学报,2005,2(22):91.

[3]邓淑华,王鸿梅,刘艳华.黄芩茎叶总黄酮抗菌作用的实验研究[J].承德医学院学报,2008,3(25):324.

[4]刘智,周晓霞,苏佩清,等.黄芩茎叶总黄酮治疗 2型糖尿病性高脂血症大鼠的实验研究[J].中药新药与临床药理,2009,1(20):5.

[5]周晓霞,尤翠兰,苏佩清,等.黄芩茎叶总黄酮对高脂血症大鼠脂代谢的影响[J].中药新药与临床药理,2009,2(20):99.

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[9]周晓慧.黄芩茎叶总黄酮对培养大鼠心肌细胞自由基损伤的保护作用[J].四川中医,2005,3(23):23.

[10]刘永平.黄芩茎叶总黄酮对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的保护作用[J].天津医药,2008,11(36):885.

[11]周晓慧.黄芩茎叶总黄酮对H2O2诱导的心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2及Bax表达的影响[J].广东医学,2007,10(28):1590.

[12]李素婷.黄芩茎叶总黄酮对原代培养大鼠肝细胞损伤的保护作用[J].时珍国医国药,2007,3(18):685.