TLR4在非酒精性脂肪性肝炎的表达及意义

窦 艳，邱 鹏，陈江伟

（邢台市人民医院，河北 邢台054031）

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是与内脏性肥胖、高血压、胰岛素抵抗和2型糖尿病相关的肝脏损伤为主的代谢性疾病。肝脏星状细胞（HSCs）及枯否细胞（KC）的活化是其发生的关键因素之一，TLR4主要存在于各种免疫细胞，而TLR4主要识别革兰阴性菌胞壁成分脂多糖（Lipolysaccharides，LPS），是LPS／TLR4信号传导通路的重要因子，本研究旨在通过60例NASH患者肝穿组织TLR4的表达来探讨TLR4在非酒精性脂肪性肝炎的作用，并研究其与星状细胞的关系。

1 材料与方法

1．1 材料 材料来源：收集邢台市人民医院和邢台市二院2000－2011年期间经过病理确诊且临床资料完整的NASH患者肝穿刺活检标本60例，年龄13－70岁，平均36岁，其中男39例，女21例。另取10例正常肝组织标本作为对照。

主要试剂：兔抗人TLR4多克隆抗体、DAB显色试剂购自福州迈新生物工程有限公司；鼠抗人α－SMA试剂盒购自北京中山生物有限公司。

1．2 方法 病理组织学观察：石蜡包埋组织切片分别进行HE染色、网状纤维染色、Masson三色染色，光镜下观察。依据1999年Brunt分级分期标准对上述标本进行分组。炎症分级：G1（n＝11）、G2（n＝35）、G3组（n＝14）；纤维化分期：S1（n＝32）、S2（n＝23）、S3（n＝5）组；脂肪变性分级：F1（n＝13）、F2（n＝30）、F3（n＝17）组。

免疫组织化学染色：采用SP免疫组化染色法。参照试剂盒说明操作，α－SMA单克隆抗体（浓度1∶300）、TLR4多克隆抗体（浓度1∶300）。

免疫组化染色半定量分析：免疫组化染色有明确的棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性。光镜观察阳性细胞在NASH肝组织内的分布并计数每视野阳性细胞数。每张切片选取5个以上典型汇管区和肝小叶，于200×视野下计算各组阳性细胞平均数，计算免疫组化阳性检出率（%）。

1．3 统计学处理 采用SPSS13．0统计软件对各组之间的差异进行χ2检验、Spearman秩相关分析等，取α＝0．05。

2 结果

2．1 α－SMA在肝穿组织中的表达 主要表达于活化的肝星状细胞，细胞浆阳性。NASH肝组织中α－SMA的阳性细胞数与表达量表达随着炎症活动分级及纤维化分期的增加而增多，且呈正相关关系（P＜0．05）。

2．2 TLR4在肝穿组织中的表达 正常肝组织中TLR4的表达无或仅存在于极个别细胞中，主要位于库否细胞及星状细胞的胞膜及胞浆，在NASH组中，它们的表达均明显高于正常对照组（表1）。连续切片免疫组化观察，α－SMA表达的星状细胞一部分表达TLR4。且TLR4在NASH组中的表达随着炎症活动程度分级和纤维化程度的升高而显著增加，且呈正相关关系。（P＜0．05，表2）

2．3 TLR4与α－SMA在不同病例的相关性 在NASH的不同病例中，TLR4的表达与α－SMA呈正相关（r＝0．245，P＝0．005＜0．05）

表1 TLR4在正常及NASH患者肝组织内的表达

3 讨论

随着人们生活的改善、生活方式和饮食结构的改变，NASH的发病率逐年增高。已是公认的隐源性肝纤维化发生的重要原因之一。但其确切发病机制仍不确定。TLR4参与的信号传导通路，在很多肿瘤及炎症、病毒引起的病变中起着重要的作用，它是否参加了NASH的发生和发展，以及和肝星状细胞的关系目前尚无研究。

3．1 肝星状细胞在NASH中的表达及意义 肝星状细胞位于肝窦周围的间隙内，在生理情况下主要参与维生素A的代谢，可在多种细胞因子及活性氧自由基的作用下激活并转化为肌成纤维样细胞，表达α－SMA，活化后的星状细胞产生大量以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质，并分泌转化生长因子β（TGF－β）、血小板源性生长因子（PDFG）等各种促纤维化因子，来促进肝纤维化的进行。本研究得出α－SMA主要表达于活化的星状细胞并和NASH炎症和纤维化关系密切。证实了活化的星状细胞促进NASH的发生及发展，是判定NASH的发展程度及预后的重要指标之一。

3．2 TLR4的生物学特性 1996年，霍夫曼实验室在研究低等生物先天免疫机理的过程中等发现一种Toll分子基因突变造成果蝇对真菌的抵抗力完全丧失，提示Toll分子参与果蝇抵抗外界真菌感染的。进一步分析提出Toll因子是一种定位于细胞膜的跨膜蛋白，可感知病原体的存在并启动机体防御的相关基因［1］。至今在动物中已经发现15种TLRs。TLRs属于表面模式识别受体 （PRR），不同的TLRs因其胞外区氨基酸组成的差异决定了各自有其特异性的配体［2］。1998年布特勒实验室发现了TLR4，并证实小鼠TLR4是LPS发挥生理功能的细胞膜受体，当TLR4结合LPS后可激活下游信号，从而引发炎症反应［3］。

3．3 TLR4在NASH中的表达及意义 人类TLR4基因定位于9号染色体上的q32、q33．TLR4属于泛生型，在体内广泛分布于各类与免疫相关的细胞如中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞等，在肝脏主要存在于肝星状细胞及枯否细胞［4］，最近的研究已经证实HSCs的激活与内毒素有关，LPS可能与其表面的TLR4结合而激活NF－κB和JNK信号通路，诱导了炎性及纤维化的相关细胞因子二促进肝脏纤维化形成［5］。Spruss等［6］的研究发现 NAFLD 患者往往摄入过多的果糖，从而使血浆甘油三酯水平升高，刺激肠道细菌大量生长并增加肠道通透性，使门静脉中内毒素水平升高，激活KC和TLR4信号途径产生和释放大量炎症相关因子和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）。

本研究中证实TLR 4蛋白表达于肝脏的部分星状细胞及枯否细胞，和文献报道一致。TLR 4在NASH组中的蛋白表达明显高于正常组，且和NASH的炎症分级和纤维化分期成正相关关系，和脂肪变性的程度无关。提示TLR 4参与的信号传导途径很有可能参与了NASH的形成，同时也促进了其炎症和纤维化的进程。本试验中TLR 4的蛋白表达和α－SMA成正相关关系。连续切片也提示TLR 4的蛋白与α－SMA阳性的活化的星状细胞关系密切，推测TLR 4在NASH中的作用是通过促进星状细胞的活化来进行的。

综合我们的实验结果表明TLR4在NASH疾病的发生发展中起了重要的作用，其在NASH中的作用很有可能是通过肝星状细胞的活化来完成的。此研究不仅为探讨NASH疾病的发生机制提供了新的方向，并为预防NASH的形成提供了一定的理论依据。

［1］Lemaitre B，Nicolas E，Michaut L，et al．The dorsoventral regulatory gene cassette sptzle／Toll／cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults［J］．Cell，1996，86（6）：973．

［2］Hayashi F，Smith K D，Ozinsky A，et al．The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll－like receptor 5［J］．Nature，2001，410（6832）：1099．

［3］Poltorak A，He X，Smirnova I，etal．1998．Defective LPS signaling in C3H／HeJ and C57BL／10ScCr mice：mutations in Tlr4gene［J］．Science，282（5396）：2085．

［4］Runping Gao，Jie Zhu，Xiujun Zhang，et al．Upregulation of tolllike receptor 4signaling pathway in human chronic pancreatitis［J］．The American Journal of Gastroenterology，2011，106（Suppl 2）：S64．

［5］王登妮，徐军全，宋维芳，等．肝纤维化过程中Toll样受体4在肝脏表达分布及意义［J］．中国比较医学杂志，2010，6（20）：17．

［6］Spruss A，Kanuri G，Wagnerberger S，et al．Toll－like receptor 4 is involved in the development of fructose－induced hepatic steatosis in mice［J］．Chin J Clinicians（Electronic Edition）2009，50：1094．