胰岛素样生长因子1对于实验性动脉粥样硬化斑块细胞组织结构的影响

刘 洋，许金鹏，刘福林

（1．保定市第二医院 心外科，河北 保定071000；2．河北大学附属医院心脏科，河北 保定071000）

动脉粥样硬化是造成心脑血管疾病的根本原因。临床工作中，大量发生急性心血管事件的患者提前没有任何可供预警的症状体征。研究认为，急性心血管事件的发生绝大多数是由于动脉粥样硬化斑块破裂诱发血栓形成造成的，在急性冠脉综合征的发生原因中，斑块破裂约占60%－75%，斑块溃疡约占25%－40%，钙化小结约占2%－7%［1，2］，这种易于破裂的斑块称为“易损斑块”。

胰岛素样生长因子1（Insulin－like growth factor 1，IGF－1）是一种受生长激素调节，与胰岛素原有高度同源性的单链多肽类生长因子。动脉粥样硬化形成过程中涉及的炎症细胞、血管平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）、巨噬细胞和血管内皮细胞均可分泌IGF－1。IGF－1能够改变细胞周期进程，抑制血管SMC凋亡，诱导SMC增殖，从而稳定动脉粥样硬化斑块，降低其易损性，理论上可以起到抑制动脉粥样硬化的作用。

易损斑块的诊断与治疗一直是临床及科研工作的热点与难点，本研究旨在探讨应用IGF－1对于动脉粥样硬化斑块细胞成分的影响，为其应用于控制斑块易损性提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 动脉粥样硬化动物模型的制备 雄性新西兰大白兔18只，随机分为3组，每组6只，分别为模型组、IGF－1干预组、辛伐他汀干预组。3组动物每天均给予高脂饲料并行球囊拉伤，制作动脉粥样硬化模型。麻醉实验动物，解剖分离股动脉。取4F Forgaty球囊插入股动脉。上行插入约30cm，向球囊内注入生理盐水，向下拖拉球囊至髂总动脉分叉处，反复3次。撤出球囊导管，结扎股动脉，缝合组织及皮肤。术后继续给予动物高脂饲料喂养10周，同时IGF－1干预组每天给予0．1mg／ml的IGF－1因子1ml腹腔注射，辛伐他汀干预组给予辛伐他汀悬浊液2．5mg／kg灌胃，模型组给予等量的生理盐水灌胃。

1．2 取材 注射过量麻醉剂处死实验动物，解剖取出主动脉固定，纵向剖开动脉，可见动脉粥样硬化斑块均匀分布于膈下至髂动脉分叉处，按动物分组做好相应标识备用。

1．3 标本病理组织结构测量 兔主动脉标本固定后，选择动脉粥样硬化斑块最明显节段，石蜡包埋动脉片段，梯度系列乙醇组织脱水，连续5μm厚度切片，固定在玻片上。组织切片用HE染色，使用NIKON NIS－ELements2．30图像分析系统采集分析图像，每个斑块至少取10处测量纤维帽厚度取平均值，测量处包括最厚与最薄处，测量每个斑块纤维帽厚度与相对应脂核横截面厚度。

1．4 免疫组化测定 应用ELISA法进行α－actin单克隆抗体标定平滑肌细胞。每例斑块标本取4张免疫组化切片，进行平滑肌细胞肌动蛋白免疫组化检测，显微镜观察，选择实验组和对照组的阳性和阴性组织相、进行400×的显微照相，棕黄色为阳性表达，选择有意义的组织相，采用多功能真彩色细胞图象分析管理系统（美国Media Cybernetics公司Image－Pro Plus）进行分析观察，读取结果。

1．5 统计学分析 统计学分析使用SPSS16．0软件包，结果以（¯x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，P＜0．05为有统计学意义。

2 结果

2．1 斑块组织结构特点

2．1．1 斑块大体组织学结构 肉眼观兔腹主动脉膈水平以下有明显的连续性动脉粥样硬化斑块，按照AHA动脉粥样硬化分型，可将斑块分为六型：1型（初始病变），Ⅱ型（脂质条纹病变），Ⅲ型（中间型病变），Ⅳ型（粥样瘤病变），Ⅴ型（纤维粥样瘤病变），Ⅵ型（Ⅴ型合并并发病变）。镜下见各组斑块表现为Ⅳ型及Ⅴ型斑块特点，斑块表面覆盖纤维帽不明显，斑块内平滑肌细胞和胶原含量相对较少。模型组斑块纤维帽较薄，脂核相对较大，而干预组斑块纤维帽较厚，脂核相对较小。

2．1．2 测量斑块纤维帽厚度，脂核厚度，并计算纤维帽厚度与脂核横截面厚度的比值。IGF－1组与模型组比较，在斑块肩部及顶部，两者差异有统计学意义；辛伐他汀组与模型组比较，二者差异有统计学意义，辛伐他汀组与IGF－1组，两者帽核比均大于模型组帽核比。而IGF－1组与 辛伐他汀组比较，二者差异无统计学意义，结果见表1。

表1 各组间斑块帽核比（¯x±s）

2．2 平滑肌细胞免疫组化

2．2．1 病理切片由一名专业人员独立阅片，相关指标定量使用免疫组化评分（IHS）。已证明，此种方法得出的数据近似于图像分析为基础的评分系统［3］。IHS包含了免疫反应阳性细胞百分比分级（质量评分）与阳性细胞显色强度分级（染色强度评分），结合两方面综合计算进行评分。阳性细胞百分比0－1% ＝0；1%－10% ＝1；10%－50% ＝2；50%－80%＝3；80%－100%＝4。阳性细胞显色强度分别为0（阴性）；1（弱阳性）；2（阳性）；3（强阳性）。IHS评分为两者评分的乘积，故评分范围为0到12。IHS评分9－12为强免疫反应，5－8为中等免疫反应，1－4为弱免疫反应，0为无免疫反应。

2．2．2 平滑肌细胞免疫组化评分（IHS）见表2。模型组平滑肌细胞含量明显较少（图1A），而IGF－1干预组、辛伐他汀干预组平滑肌细胞含量相对较多（图1B）。由表2可见，两干预组平滑肌细胞含量均与模型组有统计学差异，而辛伐他汀组平滑肌细胞含量增多趋势最明显。

表1 各组间斑块平滑肌细胞免疫组化IHS（¯x±s）

图1 平滑肌肌动蛋白抗体主要在细胞浆表达（×400）

3 讨论

动脉粥样硬化是导致冠心病和缺血性脑卒中等急性心脑血管事件的主要原因。目前的研究认为，决定患者是否易于发生急性血管事件的关键因素是斑块的稳定性，而不是简单的斑块体积大小［4］。动脉粥样硬化比较严重的患者并不一定发生急性血管事件，相反，某些仅造成轻／中度管腔狭窄的斑块更易于破裂诱发血栓形成，这种斑块被称为易损斑块。易损斑块通常脂质核心相对较大，而纤维帽相对较薄，更容易发生破裂、溃疡和糜烂，这些病理改变的直接后果是引发血小板瀑布反应，造成血小板聚集形成血栓。所以，早期进行药物或其他干预，改善动脉粥样硬化斑块的易损性，具有非常明显的临床与社会意义。

胰岛素样生长因子1是一种受生长激素调节，与胰岛素原有高度同源性的单链多肽类生长因子［5，6］。动脉粥样硬化形成过程中涉及的炎症细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞均可分泌IGF－1［7，8］。IGF－1能够改变细胞周期进程，抑制血管SMC凋亡，诱导SMC增殖。Ruiz等人的体外实验显示［9］，IGF－1通过与受体结合可以刺激血管平滑肌细胞的增殖和迁移，影响动脉粥样硬化的进程。SMC可产生胶原，胶原对维持纤维帽的张力和强度非常重要［10］，SMC凋亡会减少胶原产生，从而减弱这种保护作用，使斑块极不稳定易于破裂。从这个角度而言，IGF－1可以用于改善动脉粥样斑块的易损性。

本研究中，平滑肌细胞免疫组化提示，IGF－1组的平滑肌细胞较模型组增多。所以，应用IGF－1可以诱导平滑肌细胞增殖，影响斑块的组织机构，使易损斑块的纤维帽厚度得到加强，从而使斑块破裂的可能性下降，达到稳定斑块的目的。他汀类降脂药对于动脉粥样硬化斑块的稳定作用已得到大量基础及临床试验的证实。本研究中，IGF－1组与他汀组在改善斑块结构方面无明显差异，但是总体趋势并不优于他汀，在调整IGF－1应用剂量及使用途径后是否能够优于他汀类药物，是本研究未来将要探索的方向之一。

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