MSCs对辐射诱导小鼠胸腺瘤中T细胞CD4／CD8各亚群及各亚群中CD45比例变化的影响

王 玲，张红梅，李东红，宋新灵，国春龙，陈玉丙，卢日峰＊

（1．吉林大学公共卫生学院，吉林 长春130021；2．吉林大学中日联谊医院唐敖庆特聘教授实验室；3．吉林大学第二医院放疗科；4．吉林省申邦生物技术有限公司）

本课题组曾进行骨髓间充质干细胞多方面的研究，首先研究了MSCs可以降低辐射诱导胸腺瘤的发生率［2］，进而从细胞水平研究了MSCs对辐射诱导胸腺组织具有损伤修复作用［3］，接下来我们应用流式细胞术从分子水平研究MSCs对辐射诱导小鼠胸腺瘤中T细胞CD4／CD8各亚群及各亚群中CD45比例变化的影响，从而说明MSCs对辐射诱导的胸腺瘤T细胞亚群的修复作用，提示MSCs对胸腺瘤具有治疗作用。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 试 剂 和 主 要 仪 器 anti－CD4－PECy5，anti－CD8－PE，anti－CD45－FITC，同型对照抗体Fluorescein isothiocyanate （FITC）Rat IgG2bIsotype Control、IgG2bIsotype Control、Rat IgG2bK Isotype Control PE－Cy5（eBioscience公司）；L－DMEM 培养基和胰蛋白酶（GIBCO 公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；CO2培养箱（Sigma公司）；FACSCalibur（美国BD公司）；飞利浦深部X线放射治疗机（美国）。

1．1．2 动物：健康C57BL／6小鼠，体重16±2g，雌性，购自吉林大学基础医学院。

1．2 方法

1．2．1 MSCs细胞的培养［4］取 C57BL／6乳鼠，脱臼处死，75%酒精浸泡片刻。无菌条件下分离股骨、肱骨，剪去干骺端，用L－DMEM 培养基反复冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液，200目滤网过滤后，1 000r／min离心5min，弃上清。用含10%胎牛血清的DMEM 培养液重悬细胞，计数，以2．0×105个／ml接种于25cm2培养瓶中，置37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，24h后弃悬浮细胞。72 h后，第1次换液，以后每3d更换培养液，当细胞接近90%融合时，用0．25%胰蛋白酶（含0．02%EDTA）消化2min，按1∶2的比例传代。待传至3代时，收集MSCs细胞，计数。

1．2．2 应用经典kaplan方法建立动物模型 将C57BL／6小鼠随机分为3组，即正常组、单纯照射组、MSCs治疗组，每组8只。应用飞利浦深部X线放射治疗机参考经典Kaplan法［3］对单纯照射组和MSCs治疗组鼠进行1．75Gy全身照射，剂量率0．287Gy／min，每周一次，共4次。末次照射后第二天，治疗组小鼠按照2×106个MSCs细胞／ml，0．2 ml／只经尾静脉注射。计时，6个月后，将鼠处死，取胸腺组织作流式。

1．2．3 流式细胞术分析胸腺细胞CD4、CD8和CD45的表达［5］无菌取小鼠胸腺，研磨制成匀浆，经400目滤网过滤，制成单细胞悬液，1 500rpm离心5 min，弃去上清，加入5ml红细胞裂解液悬浮细胞，室温放置5min。1 500rpm离心5min，弃去上清，PBS洗涤2次，计数，以2×105～1×106个细胞／100μl，分 别 加 入 anti－CD4－PECy5，anti－CD8－PE，anti－CD45－FITC，并设同型抗体对照。室温避光孵育30min。PBS洗涤2次，流式细胞仪FACSCalibur采集信息，CellQeust Pro软件分析数据。

1．3 统计分析 计量资料采用SPSS17．0软件进行数据分析，结果以均数±标准差（¯x±s）表示。多组间比较用方差分析，显著性水准α＝0．05。

2 结果

2．1 流式细胞术分析胸腺细胞中CD4CD8各亚群的表达

正常组、辐射组、MSCs治疗组3组小鼠在6个月后处死，取胸腺，做成单细胞悬液做流式。流式细胞术分析结如图1所示，表明照射之后CD4＋CD8＋显著增加，MSCs治疗后有向成熟T细胞CD4＋CD8－和CD4－CD8＋发展的趋势。经统计分析显示：照射后CD4－CD8－亚群比例由正常组的（5．11±5．10）%降低到（0．01±0．01）%，差异有统计学意义（P＜0．05），MSCs治疗（0．61±0．39）%后有所恢复；MSCs治疗组（91．49±4．47）%中 CD4＋CD8＋亚群比例与正常组（82．44±6．06）%接近，单纯照射组（99．09±0．49）%显著高于正常组（P＜0．05）；照射后CD4＋CD8－亚群由（7．72±3．37）%下降到（0．87±0．49）%，CD4－CD8＋亚群由（4．74±2．59）%下降到（0．02±0．01）%，MSCs治疗后 CD4＋CD8－和CD4－CD8＋都有不同程度上调，见表1。提示MSCs具有修复辐射造成的胸腺损伤的功能。

表1 不同组别中小鼠胸腺细胞CD4CD8各亚群占CD4CD8胸腺细胞的百分率（¯x±s）

图1 流式细胞术分析辐射诱导C57BL／6小鼠胸腺瘤模型胸腺T细胞亚群

2．2 流式细胞术分析胸腺细胞CD4CD8中CD45＋的表达

流式细胞术分析结果如图2所示，表明治疗组CD45＋在CD4＋CD8＋中的比例与正常组接近，而辐射组与正常组差别较大。经统计学分析显示：正常组、单纯照射组、MSCs治疗组中CD45＋在CD4＋CD8＋中 的 比 例 分 别 为 （86．09±2．24）%、（0．16±0．03）%、（97．35±3．23）%，差异有统计学意义。单 纯 照 射 组 中CD4－CD8－、CD4－CD8＋和CD4＋CD8－中CD45＋有不同程度的降低，MSCs治疗组有不同程度升高，且具有统计学意义，如表2所示。

表2 各组小鼠胸腺细胞中CD45＋在CD4CD8细胞中的百分率（¯x±s）

图2 不同组别中CD45＋在胸腺细胞CD4＋CD8＋中的表达

3 讨论

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在再生医学中众所周知，且被广泛使用，因为它不仅对伤口的愈合有效，而且可以促进皮肤再生。此外，据报道，干细胞移植还可以降低炎症反应和诱导血管生成［6］。许多研究已证实，当皮肤或其它部位损伤之后，MSCs迁移到损伤部位。Badiavas等发现尾静脉注射GFP标记的MSCs在没有GFP的小鼠皮肤中被发现。这表明损伤刺激MSCs迁移到损伤部位，也可以分化为有功能的皮肤细胞。这是由于炎性细胞因子引导了伤口的位置并产生趋化迁移，从而引起MSCs移向伤口部位。

胸腺是机体的造血器官，能产生淋巴细胞，并将其运送到淋巴结和脾脏等处。这种淋巴细胞对机体的细胞免疫具有重要作用。胸腺是T细胞发育分化成熟的场所，是重要的中枢免疫器官。胸腺细胞是机体细胞免疫功能的基础，同时，胸腺细胞受体（CD分子）的表达是胸腺细胞信息传递系统的重要环节。胸腺细胞按照CD4、CD8标志区分可分为CD4－CD8－、CD4＋CD8＋、CD4－CD8＋和CD4＋CD8－4个亚组，它们分别代表胸腺细胞成熟分化的不同阶段。早期的胸腺细胞前体CD4－CD8－双阴性细胞不足胸腺细胞总数的3%，随后发育为普通胸腺细胞CD4＋CD8＋双阳性细胞，并受到严格的阳性选择。经过阳性选择后的T细胞还必须经过阴性选择过程，才能成为具有识别外来抗原的成熟的T细胞CD4－CD8＋和CD4＋CD8－。研究资料表明：由于在胸腺细胞各亚组中CD4－CD8－细胞对辐射最为敏感，因此，X射线全身照射小鼠后，，使在正常情况下占胸腺细胞4．81%的CD4－CD8－细胞迅速下降到0．01%。成熟的T淋巴细胞CD4－CD8＋和CD4＋CD8－经照射后迅速下调，转化为普通胸腺细胞CD4＋CD8＋，MSCs治疗后有向成熟细胞CD4－CD8＋和CD4＋CD8－分化的趋势。

CD45分子为I型跨膜蛋白，通过激活蛋白酪氨酸磷酸酶调节信号传导，维持T淋巴细胞正常活化。其几乎表达于所有有核白细胞，在同一细胞系的不同发育阶段，细胞越幼稚、分化越低、则CD45表达越少［7］。Ulyanova 等［8］研 究 显 示，缺 乏 CD45 的CD4＋、CD8＋T细胞，其抗原特异增殖能力、分泌干扰素（IFN－γ）能力以及溶解靶细胞能力均降低。本研究显示，MSCs通过尾静脉输注到辐射诱导的C57BL／6小鼠胸腺瘤模型体内，模型组CD45＋在CD4－CD8－、CD4＋CD8＋、CD4－CD8＋和CD4＋CD8－中的百分率均低于正常对照组，而治疗组CD45＋在CD4＋CD8＋、CD4－CD8－、CD4－CD8＋和CD4＋CD8－中的百分率均高于辐射组，提示MSCs可使CD45＋表达增高，从而活化了T细胞，对辐射损伤的胸腺瘤起修复作用。

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