疫苗免疫压力下新城疫病毒的动态演化

秦卓明，徐怀英，刘玉山，黄 兵，李玉峰，黄迪海

(1．山东农业科学院家禽研究所，济南 250023;2．山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，济南 250023;3．山东省健牧生物药业有限公司，济南 250100)

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种禽的急性、高度传染性疾病，是世界公认的两大最重要的烈性禽类传染病之一。新城疫自1926年被确诊以来，在世界范围内已肆虐86年，在中国的危害也超过70余年，给养鸡业带来了巨大的灾难。由于NDV对养禽业具有高毁灭性，世界大部分发达国家普遍采取捕杀办法扑灭该病。限于国情，我国采取的是强制疫苗免疫预防策略［1］。

30多年来，疫苗免疫对中国新城疫的防控起到了决定性的作用，新城疫的发病率大大降低。但是，伴随养禽业规模的不断扩大，养殖密度的不断提高，鸡、鸭、鹅等多种禽类混合饲养，特别是各式各样弱毒苗和灭活苗的大量使用，使得NDV在强大的疫苗免疫压力下，出现了不同程度的免疫逃避、基因突变、病毒重组、免疫耐受等现象，甚至在高抗体水平下发病，这无疑对于传统的新城疫免疫预防提出了挑战。

1 高度重视新城疫对中国养禽业危害的严重性

新城疫的免疫预防一直是各级政府和兽医主管部门关注的焦点。自2005年以来，我国新城疫发生的频率、数量和规模总体在减少，但每年仍然至少有一半以上的省、市和区有该病发生的报道(表1)［2］。众多的临床病例表明，新城疫仍然是养鸡业必须关注的重点疫病。

表1 2005年5月-2012年6月新城疫发病统计表

2 疫苗免疫压力下的新城疫病毒的遗传学变异

新城疫疫苗是发展中国家预防新城疫的重要方法。NDV的免疫导致抗体产生，而抗体反过来又会抑制病毒的繁殖。病毒为了生存，必然要逃避体内已有的抗体，否则就会被抗体所消灭。这种通过体液免疫和细胞免疫应答的形式限制、消灭或清除病毒的方式，构成了针对病毒本身的特异性免疫压力，通常称为免疫选择压。现代的分子遗传学技术清楚地表明，病毒为了生存，其本能就是利用病毒基因中序列突变的多样性，产生免疫逃避。

2．1 F基因的遗传变异 由于疫苗的广泛应用，目前的NDV流行株基因型已发生较大改变。流行病学调查充分显示，基因Ⅶd亚型在我国当前NDV流行株中占有绝对优势，与经典疫苗La Sota株(基因Ⅱ型)核苷酸同源性不足78%。扬州大学在2005－2008年间分离的60株NDV中，有58株属于Ⅶd亚型［3］。中国动物疫病流行中心2005－2006年间收集的145株NDV毒株，有141株Ⅶd亚型［4］。山东农科院家禽所2006－2012上半年期间，山东家禽所分离的38株NDV流行株中，Ⅶd型毒株为35株，占92．1%。此外，我国近期流行的NDVⅦd亚型毒株又分为不同的分支，不同的年代又有一定的差异。

值得关注的是，在我们的周边国家和地区，基因Ⅶ型NDV十分普遍，如韩国2000－2006年［5］、日本2001－2007 年［6］、马来西亚2004 －2005 年［7］均发生基因Ⅶ型新城疫，且大多数为Ⅶd型。

2．2 HN基因的遗传变异 通过对1997－2005年分离的72株中国分离株和国内广东、上海、江苏、云南等16株NDV野毒的HN基因同源性比较发现［8］，尽管其地域、宿主和品种(肉种鸡、蛋鸡、商品肉鸡、鹅、鸭、鹦鹉等)不同，但其HN基因全长序列无论是核苷酸还是氨基酸均高度同源:核苷酸同源性为94．4% ～100%，氨基酸同源性为94．6% ～100%，但与疫苗株La Sota、B1和V4等的核甘酸同源性仅为79．8%左右，氨基酸同源性为86．9% ～89%。值得关注的是:与新城疫病毒抗原性密切相关的HN基因氨基酸5个关键位点中至少已有3个位点与疫苗株相比发生了改变。该结果再次证实，目前的NDV流行株与经典La Sota等疫苗株相比，已经在临床上发生了明显的变异。

2．3 NDV核心基因变异的生物信息学分析 Miller等［9］利用生物信息学方法，结合大量的NDV基因组序列，对于影响NDV基因组变异的各种进化因素进行了分析和评估。在NDV编码的6个基因中，以F融合蛋白的变异频率最高。所有的氨基酸均处于较强的稳定和保守状态(亦有人称为“纯化状态”)，在免疫选择压力下，F融合蛋白显示出较多的蛋白突变位点。有趣的是，F蛋白裂解位点却相对保守。在来源于野鸟的毒株中，毒力较强的毒株比弱毒株在F蛋白上显示出较多的突变位点，由此推测:NDV毒株的进化可以改变病毒的毒力。

Yee等［10］对世界上不同历史时期、不同国家、不同禽种的54个NDV代表株全长的不同基因，分别进行了生物信息学统计分析。结果表明:NDV病毒存在不同程度的核苷酸突变，且不同基因之间的分子变异频率有一定差异，其中以P基因变异的频率最大，其次是F和HN基因。总所周知，在遗传学中，dN/dS表示的是异义替换(dN)和同义替换(dS)之间的比例。这个比例可以判断是否有选择压力作用于这个蛋白质编码基因。如果dN/dS＞1，则认为有正选择效应。如果dN/dS=1，则认为存在中性选择。如果dN/dS＜1，则认为有纯化选择作用［10］。一般认为，同义突变不受自然选择，而非同义突变则受到自然选择作用。Yee等［10］通过特异性位点选择法证实，NDV编码区的所有基因，其非同义突变和同义突变(dN/dS)之比均小于1(表2)，表明NDV的进化主要以自我纯化为主，变异的频率相对较小。研究同时表明:在自然状态下，P基因和HN基因变异的几率较大，而疫苗的免疫常常导致M基因和F基因变异较大。尽管如此，几乎所有的编码基因均以自我纯化为主，突变率通常被局限在一定的范围内，病毒仍具有较高的保守性。

表2 利用特异性位点选择理论分析疫苗免疫与否对NDV不同编码区的影响

2．4 免疫压力下F和HN基因在实验室条件下的变异依据 巩艳艳等［11］在细胞培养上研究了NDV抗体对其HN基因和F基因变异的影响(表3)。结果发现，有抗体组HN基因发生突变的氨基酸位点数明显多于无抗体组，且非同义突变(NS)与同义突变(S)比值NS/S为6，明显高于无抗体组的NS/S比值3．4。在有抗体组，有5个碱基位点发生稳定的非同义突变，而且其中3个与已知的抗原表位密切相关。F基因在有抗体组也出现了2个稳定的突变，无抗体组未发生变化。但不论在有抗体还是无抗体组，F基因变异的NS/S比均小于2．5。该结果证实:抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异，但对F基因变异的影响小于HN基因。该结果提示，因使用La Sota疫苗所造成的免疫选择压可以导致HN基因抗原性的变异。

表3 新城疫抗体对其自身F和HN基因的影响

3 新城疫病毒自身的基因突变和重组

NDV属于单股负链RNA病毒，具有RNA病毒共有的特征，即缺乏高效的RNA校正酶，加上病毒本身具有较高的复制效率(二十多分钟一代)，代次间隔时间短，病毒自我纠错能力有限，使得病毒自身的变异频率相对于DNA病毒来讲相对较高。

3．1 自然状态下的NDV变异 NDV抗原性的变化是一个逐步积累的过程，点突变是NDV变异的主要方式，其根本原因是RNA聚合酶缺乏矫正能力。尽管NDV的核苷酸变异频率(0．98×10－3～1．56 ×10－3/年)远远低于流感病毒(3．4 ×10－3/年)，但NDV的变异已成为不争的事实。NDV基因每年的核苷酸自然突变率一般不高于0．1%，但对于其15．6万个碱基来讲，已是一个不小的数据。以澳大利亚为例，因该国相对隔离，该地仍以基因Ⅰ型的弱毒株为主，但目前的毒株与20年前的毒株已有较大差别。

研究同时表明，即便是对于同一基因的不同基因型，其变异的程度亦存在差异，以基因Ⅶ的变异频率较大，而在所有的基因型中，以基因Ⅱ型相对比较稳定。当然，基因Ⅱ型的毒株如La Sota等是目前的主要疫苗候选毒株，这也许是大自然给予养鸡业的一种恩惠。

3．2 不同历史时期的NDV基因型 病毒本身的变异积累导致了病毒在不同时期的基因型不同。第一次新城疫大流行，发生在20世纪60年代以前，NDV流行株主要是基因II、III和IV型类型的毒株，危害的对象主要是鸡，历时近30年，经亚洲和欧洲传至世界各地;最近，在非洲的马达加斯加仍然有IV型的现代版毒株，不过其抗原性和基因型已经有了较大的变化，甚至成为一种新的基因型。第二次新城疫大流行，源头在北美洲，时间在1970－1980年间，基因型为V，病原来源于珍禽，然后危害到鸡;第三次新城疫大流行，源头在中东的鸽子，时间为1980－1990年，基因型为Ⅵ，对鸡有一定的致病性。第四次新城疫大流行，源头比较复杂，与水禽有一定的相关性，基因型主要是Ⅶ，不同的地域、不同的时间，各地流行的Ⅶ型也有差异。南非、中东、欧洲主要流行Ⅶb型，而亚洲东部包括中国内地以及于中国的台湾和香港、南韩、日本等地主要流行Ⅶ型中的a、c、d、e等亚型，且以Ⅶd型为主。

3．3 NDV的重组 有关NDV重组的报道最早始于Chare的研究［12］。他在进行负链RNA遗传进化的研究中发现，在负链RNA病毒的系统进化分析中，从35个负链RNA病毒不同基因片段的2154个序列中，至少发现有5种病毒的79个基因片段可能发生了重组，其中就包括NDV、Hantaan病毒和麻疹病毒(Mumps Virus)。尽管频率较低，但仍存在着一定比例的同源重组。耐人寻味的是，首次被证实可能发生重组病毒的两株NDV，一株就来自中国的鹅源ND强毒GPMV/QY97－1(简写QY97－1)，是最早在国内发生的Ⅶ型NDV的“鼻祖”。另一株则是来自墨西哥的chicken/Mexico/37821/96(简写Mexico)。QY97－1是我国最早在南方分离的对鹅有致病性的NDV强毒。通过对其HN基因序列分析，其5端1～273个氨基酸与我国目前广泛流行的Ⅶ型NDV(代表株ZJ/1/00/Go)同源性在97．7%，而274～570氨基酸则与我国的经典强毒F48E9同源性在99．7%，很明显QY97－1是我国经典强毒F48E9和Ⅶ型NDV流行毒在HN基因水平上的病毒重组［13］。而Mexico毒株的重组则发生在N基因，是 chicken/Mexico/37822/96和 chicken/Italy/Milano/45的重组。更为惊奇的是，这两个亲代毒株竟然来自相差50年并且来源于欧洲和美洲这两个不同的大陆。人们推测可能是chicken/Italy/Milano/45远渡重洋，产生后代的结果。

Miller等［9］利用生物信息学方法，结合大量的NDV基因组序列分析，对影响NDV基因组变异的各种进化因素进行评估和分析，证实NDV大多数基因可以发生重组，并且有一例基因Ⅴ的毒株，其F基因发生了重组。

QIN等［14］的分离鉴定的名为SRZ03株一株新城疫野毒，重组发生在F基因，尽管其HN、L、P、M、N基因均属基因Ⅱ群Ⅶ型NDV，但其F3773－4156片断很明显与疫苗相关的基因Ⅱ毒株相关，而其他部分基因均与流行的Ⅶ型NDV有关。

3．4 对重组的质疑 一些多年从事NDV研究的学者对于NDV是否发生重组表示怀疑。Song Qingqing等［15］通过对以前报道的重组株 China/Guangxi09/2003和NDV/03/018进行了跟踪研究，发现上述毒株并非是重组株，而是由于NDV分离株不纯，导致测序结果不准确造成的。因此，他们建议对分离株进行克隆测序前必须进行蚀斑纯化三代以上。

目前有关NDV的重组尚存在争论，还缺乏强有力的实验室证据。因为，尽管NDV重组的潜在能力存在，但其严格的实验室条件尚需要摸索。

4 免疫压力下新城疫病毒的抗原性变异证据

通过病毒中和试验(VN)、血凝交叉抑制试验(HI)、酶联免疫吸附法(ELISA)和琼扩试验(AGP)等大量的研究数据表明，NDV不同毒株和分离株之间已经发现有一定的抗原性差异，尽管这些差异有大有小，甚至相互之间不能产生较好的交叉保护，免疫失败的现象时有发生，但大部分的分离株之间均存在一定的交叉反应，其抗原性相关指数R值均未突破成为不同血清型的阈值［1，16－17］。因此，NDV只有一种血清型，不同毒株间能够产生不同程度的交叉保护。

4．1 NDV不同毒株间的交叉中和能力 有研究表明:La Sota、Clone30等疫苗对经典强毒F48E9之间中和相关指数(R)较高，为0．77(一般超过0．5就可以达到较好的保护)，显示出较强的交叉保护能力，但对于目前的NDV流行株中和能力则相对较低，R 普遍低于0．5［16］。其中，仅有15%的 NDV 强毒与疫苗株 La Sota间的同源性在0．5以上，而85%的NDV流行毒与La Sota和F48E9的同源性已降至 0．15 ～0．5［16］。而且，即使同属于基因Ⅶ型毒株间抗原的同源性变化在0．17 ～0．98 间［15］。

4．2 NDV不同毒株间 HI交叉抑制 研究表明［17］:La Sota与Clone30和经典强毒株F48E9的HI抗原同源性最高，分别为0．97和0．98，而与17个流行株的抗原同源性为0．70～0．97，出现了明显的差异。具体来讲，23．5%的NDV流行毒与经典强毒株F48E9和疫苗株La Sota间的同源性在0．9以上，但52．9%的NDV流行毒与疫苗株La Sota和经典强毒株F48E9的同源性已降至0．70～0．85。

4．3 动物免疫交叉保护能力 Miller等［18］用F基因分属于不同基因型的五种疫苗:如 B1(ClassⅡ/Ⅱ)、Ulster(ClassⅡ/Ⅰ)、CA02(ClassⅡ/Ⅴ)、Pigeon84(ClassⅡ/Ⅵb)、Alaska196(ClassⅠ)和正常尿囊液对照分别免疫4周龄SPF鸡，免疫三周后利用不同的抗原检测结果发现，同源性抗原免疫抗体较高，反之则相对较低，差异明显。而ELISA抗体差异不大，显示出 NDV毒株内部的联系性(表4)。利用CA02攻毒，结果表明，除AK196有1只死亡外，其他组均有一定程度的保护，但在攻毒后排毒方面有一定差异，同源的相对排毒率较低，反之，则高。

Cho等［5］以 La Sota疫苗基因组为骨架，将韩国流行的Ⅶd亚型KBNP－4152的F和HN基因替代La Sota基因组的相应部分，并对基因组进行了一系列的基因突变，成功获得了相应的致弱毒株。以该毒株和La Sota制成灭活疫苗分别免疫115日龄的蛋鸡，并在免疫后3周再以另外的一株Ⅶ型SNU5074攻毒，结果显示，攻毒后2周和4周，重组疫苗的产蛋率分别为93．2%和94．3%，而La Sota免疫组的产蛋率仅为81．7%和87．3%，比Ⅶd亚型免疫组降低10%左右。

表4 疫苗免疫3周不同抗原检测的HI抗体平均滴度和ELISA滴度

Min Gu等［19］利用重组的鸡痘构建了疫苗株La Sota HN基因的 rFPV－La SHN(携带 V266，E347和T540位点)病毒和基因Ⅶ流行株Go/JS6/05 HN基因 rFPV－JS6HN(携带 A266，K347和 A540位点)病毒，分别免疫SPF鸡，三周后利用Go/JS6/05流行毒进行攻毒，结果证实，rFPV－JS6HN表现出比rFPV－La SHN更好的免疫效果。

以上试验结果表明:不论是HI交叉抑制，还是中和反应以及动物交叉免疫试验，都证实目前中国的NDV流行毒已经在抗原性上逐渐偏离经典疫苗La Sata株。

5 对新城疫病毒的防控建议

在目前禽病复杂、饲养密度大、家禽和水禽混养等的情况下，生物安全措施作为最基本的措施，显得更加重要。疫苗免疫只能中和机体体液中的病毒，尽可能减少NDV侵入机体内的数量，降低发病率，但决不能阻止NDV进入鸡群，更不能消灭鸡群体内特别是细胞内已经存在的病毒。鸡群如果暴露于强病毒包围的环境中，即使是免疫鸡群，感染率也是极高的。作为群体免疫应答这一生物学系统，即使是频繁接种各种新城疫疫苗，由于个体免疫的差异，也不可能产生100%的保护。正因为如此，建立健全的生物安全体系至关重要。

鉴于近5年来，引起我国新城疫的流行株主要为Ⅶd亚型，而最常用的新城疫疫苗株主要为基因Ⅱ型的La Sota株，优势流行株与疫苗株的遗传距离愈来愈远，即使经典疫苗株可诱导产生高滴度的新城疫抗体，但在流行毒强毒攻击后仍不能得到良好的保护，进而导致免疫的失败。扬州大学利用反向遗传操作构建的基因Ⅶ型疫苗研究表明［20］，基因Ⅶ型疫苗比传统疫苗具有以下优势:首先是抗原性和基因型的统一，经过改造的Ⅶ型毒株与大多数流行株一致，均为基因Ⅶd亚型，而在进行致弱和基因修饰后，疫苗备选株NDV/ZJ1HN已成为弱毒，在SPF鸡胚盲传15代无返强，毒力相当稳定;二是可有效阻止基因Ⅶ病毒在动物体内的复制，不仅能降低攻毒后鸡的排毒率，还可有效降低喉气管和泄殖腔中的排毒率，有效降低病毒排毒10倍以上;三是对鹅、鸭等水禽具有更好的免疫效果;四是比经典疫苗La Sota株产生较高的抗体。

新城疫的防控是一个系统工程，消灭该病的任务十分艰巨，必须依靠科学，制定长远的疫病控制和消除计划，才能彻底根除新城疫的危害!

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