苏丹红Ⅰ磁性分子印迹聚合物的制备及其分离分析应用

马 洁，黄 静，曾延波，张祖磊，张 剑，陈智栋，李 蕾*

(1．常州大学 化学化工学院，江苏 常州 213016;2．嘉兴学院 生物与化学工程学院，浙江 嘉兴 314001)

分子印迹聚合物具有预定选择性、化学性质稳定、对环境的耐受性好和制备简单等优点，因此在固相萃取、传感器、催化等领域得到广泛应用［1－4］。磁性分离是在磁场的作用下依据物质的磁性差异，将磁性组分与非磁性组分分离的一种技术［5］。将磁性分离技术与分子印迹技术相结合制备的磁性分子印迹聚合物(M-MIPs)，兼具分子印迹聚合物和磁性材料的特点，可选择性分离富集分析物，使之在外磁场的作用下快速与基质分离。近年来基于磁性材料的分子印迹聚合物逐渐成为研究热点。

苏丹红是一种人工合成的工业染料，国际癌症机构将其列为三类致癌物质［6］，但一些不法食品企业将其作为食品色素，严重危害消费者健康。目前食品中苏丹红Ⅰ的检测方法主要有HPLC法、GCMS联用法、电化学检测法等［7－10］，而这些方法大都需要繁琐的样品前处理过程。用分子印迹聚合物作为萃取材料，可简化样品前处理过程［11－14］，但通常需将其离心分离或者用于填充柱，分离过程仍较繁琐，而M-MIPs在外磁场作用下可与基质快速分离，因此，M-MIPs的使用降低了样品预处理的复杂性，提高了方法的可靠性。本文以3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)修饰的 Fe3O4为磁性组分，以苏丹红Ⅰ为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，制备了磁性分子印迹聚合物，并将其用于辣椒粉提取液中苏丹红Ⅰ的分离富集，在外磁场下实现快速分离，用甲醇洗脱，并结合液相色谱法进行检测。该方法具有操作简单、选择好、回收率高等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2550型紫外可见分光光谱仪(日本岛津公司)，Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，NEXUS470型傅立叶变换红外光谱仪(美国热电尼高力公司)，Hitachi s-4800型扫描电子显微镜(日本日立公司)，JEM-200CX型透射电子显微镜(日本JEOL公司)，Lake Shore 7410型振动样品磁强计(美国Lake Shore Cryotronics公司)。

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)(分析纯，上海晶纯试剂有限公司);苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、氨水、乙酸(分析纯)及甲基丙烯酸(MAA，化学纯，使用前提纯)均购于国药集团化学试剂有限公司;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，98%)、偶氮二异丁腈(AIBN，98%)(使用前提纯，上海百灵威有限公司);甲醇、氯仿、乙腈(分析纯);超纯水(实验室自制);辣椒粉购于当地超市。

1.2 苏丹红Ⅰ磁性分子聚合物(M-MIPs)的制备

取2 g制备的Fe3O4颗粒［15］于三口烧瓶中，加入38 mL无水乙醇和2 mL水，再加入0.4 mL MPS，超声0.5 h后，在回流温度下搅拌反应3 h［16］得到MPS修饰的Fe3O4颗粒。

取1 mmol(0.25 g)苏丹红Ⅰ溶于50 mL乙腈中，加入4 mmol(0.34 mL)MAA超声0.5 h后，加入10 mmol(1.89 mL)交联剂EGDMA、1 g MPS修饰的Fe3O4和0.1 g引发剂AIBN，N2氛围下65℃聚合反应24 h。空白印迹聚合物(M-NMIPs)的制备方法同上，只是制备过程中未加模板分子。

M-MIPs用索氏提取器抽提(抽提液为体积比为9∶1的甲醇－乙酸)直至检测不到模板分子，用甲醇洗去残留乙酸后，于60℃真空干燥过夜。

1.3 聚合物的吸附性能测试

1.3.1 静态吸附性能研究 称取20 mg M-MIPs加入到锥形瓶中，然后分别加入5 mL不同浓度(0.3～3.0 mmol/L)的苏丹红Ⅰ－乙腈标准溶液，室温振荡12 h后，用磁铁吸附M-MIPs，取清液用紫外可见分光光度法测定平衡时苏丹红Ⅰ的浓度，根据吸附前后的浓度变化，计算M-MIPs对不同浓度苏丹红Ⅰ溶液的吸附量Q，其公式为Q=(C0－Ce)V/m，其中Q为静态平衡时的吸附量(μmol/g)，C0为底物的初始浓度(mmol/L)，Ce为吸附平衡时清液的浓度(mmol/L)，V为底物溶液的体积(L)，m为磁印迹材料的加入量(g)。M-NMIPs使用上述方法测定结合量并与M-MIPs相比较。

1.3.2 选择性吸附实验 为研究聚合物的选择性，将苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅲ(结构式见图1)作为底物，用平衡吸附实验研究聚合物的识别性能。将20 mg M-MIPs放入5 mL分别含有1.0 mmol/L的苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅲ的乙腈标准溶液中，室温振荡12 h后，用磁铁吸附聚合物，取清液用紫外可见分光光度法测定平衡时底物的浓度，根据吸附前后的浓度变化，计算聚合物对3种底物的结合量，M-NMIPs使用同样方法测定。

图1 苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅲ的分子结构式Fig.1 Molecular structures of SudanⅠ，SudanⅡand SudanⅢ

1.4 样品加标处理及萃取过程

在1 g辣椒粉表面喷洒1 mL的苏丹红Ⅰ－乙腈溶液(加标浓度为1.5～60 μg/g)，静置过夜后，用5 mL乙腈超声提取10 min，离心取上清液，残渣再重复提取2次，合并提取液。

将60 mg M-MIPs加入到提取液中，振荡吸附12 h后用强磁铁将吸附剂与清液分离。用2 mL甲醇溶液对吸附剂超声洗脱，洗脱液经0.45 μm有机滤膜过滤后，再使用高效液相色谱进行检测，计算回收率。

色谱条件:Agilent 1200 HPLC系统包括G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1316A柱保温箱，G1315D二极管阵列检测器，G1329A进样器。色谱柱:反相Extend－C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，柱温:35℃;流动相:50%甲醇水溶液－色谱纯甲醇(10∶90);检测波长:478 nm;流速:1.0 mL/min;进样体积:10 μL。

2 结果与讨论

2.1 磁性分子印迹聚合物的制备

本文利用MPS修饰的Fe3O4粒子为磁性组分，制备了苏丹红Ⅰ的磁性分子印迹聚合物，具体制备路线及应用如图2所示。

图2 苏丹红ⅠM-MIPs的制备与应用过程Fig.2 Schematic diagram of the fabrication and application process of SudanⅠM-MIPs

2.2 红外光谱分析

图3是各‖种聚合物的红外表征图谱。2 919 cm－1和2‖ 857 cm－1是饱和C—H的伸缩振动峰，1 750 cm－1是MPS中CO的伸缩振动峰，1 620 cm－1为MPS中CC双键的伸缩振动峰，1 123 cm－1为MPS中Si—O键的伸缩振动峰，580 cm－1处为Fe3O4中Fe—O键的特征吸收峰。对比曲线a、b可知MPS已经成功结合到Fe‖3O4粒子的表面［16－17］。M-MIPs曲线(c)中，1 460、1 390 cm－1处是甲基的面内弯曲振动峰，聚合物中CO的振动峰(1 732 cm－1)显著增强。

图3 Fe3O4纳米颗粒(a)、MPS修饰的Fe3O4(b)和M-MIPs(c)的红外光谱图Fig.3 FT－IR spectra of Fe3O4nanoparticles(a)，Fe3O4modified with MPS(b)and M-MIPs(c)

2.3 磁性分子印迹聚合物的形貌结构分析

用扫描电镜/透射电镜(SEM/TEM)对各磁性微球的形貌结构进行分析。由图4A中Fe3O4的SEM/TEM图可以看到，用共沉淀法制备的Fe3O4磁性颗粒呈规则的球形结构，且粒径比较均匀。由图4B可以看到，由于在MPS修饰的Fe3O4微球表面进行印迹聚合作用，使得部分M-MIPs微球稍有粘连现象;从M-MIPs的TEM图可以看到，其外壳薄膜厚度较大，这是由于聚合反应过程中参与反应的有机物的量很多，从而导致聚合物的有机物层变厚［18］，说明已成功制备得到M-MIPs。

图4Fe3O4纳米颗粒(A)及M-MIPs(B)的TEM/SEM图Fig.4 TEM/SEM images of Fe3O4nanoparticles(A)and M-MIPs(B)

2.4 磁性分子印迹聚合物的磁性能表征

考察了几种材料的常温磁滞回归曲线(见图5A)。由图可知，由于Fe3O4颗粒表面包裹物的增加，Fe3O4颗粒、MPS修饰的Fe3O4、M-MIPs的饱和磁化强度依次降低。图5B中左侧为MMIPs的分散液，右侧为在外磁场下M-MIPs的分散液，可以看出M-MIPs具有良好的磁性能，在强磁铁的作用下，分散了M-MIPs的溶液立刻澄清，表明M-MIPs可满足磁分离需求。

图5 几种材料的常温磁滞回归曲线(A)及M-MIPs在外磁场下的分离示意图(B)Fig.5 The magnetization curves of several materials(A)and the separation process of M-MIPs in the presence of an external magnetic field(B)a．Fe3O4nanoparticles，b．Fe3O4modified with MPS，c．M-MIPs

2.5 吸附等温线

采用静态平衡法，测定了印迹聚合物和非印迹聚合物对不同浓度苏丹红Ⅰ的吸附等温线(见图6)。

分子印迹聚合物的结合特性常用Scatchard模型［19］来评价:Q/Ce=(Qmax－Q)/Kd，式中Kd是平衡离解常数，Qmax和Q分别为M-MIPs对苏丹红Ⅰ的最大吸附量和理论平衡吸附量(μmol/g)。

以Q/Ce对Q作图即得 Scatchard曲线(图7)，M-MIPs对苏丹红Ⅰ的吸附作用并非完全等价，而是存在两类不同的结合位点。将图中线性较好的两个部分分别进行拟合，得到拟合线性方程:Q/Ce=－1.127Q+95.33(r=0.977 8)和Q/Ce=－0.308Q+64.83(r=0.998 8)。由线性方程的斜率和截距可以求得Kd1=0.89 mmol/L，Kd2=3.25 mmol/L，Qmax1=84.59 μmol/g，Qmax2=210.49 μmol/g;M-NMIPs的 Scatchard 曲线则是一条线性相关曲线，表明M-NMIPs的结合位点各向同性，所以只能形成一种非选择性的结合位点。

2.6 选择性吸附

采用静态平衡法研究了聚合物对苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的选择吸附性，并根据公式:KD=Qe/Ce计算出对应的分配系数KD及相对选择系数k(见表1)。式中KD为分配系数(L/g)，Qe为平衡吸附量(μmol/g)，Ce为吸附液中结构类似物的平衡浓度;k=KD(template)/KD(analogue)［20］。

由表1可以看出M-MIPs对苏丹红Ⅰ的KD最大且明显高于M-MIPs对其他两种物质的KD，表明其对苏丹红Ⅰ的吸附能力最强，而M-NMIPs对3种结构类似物的KD较小且相差不大，表明其对3种物质的吸附能力较低且相差不大;M-MIPs对苏丹红Ⅰ/苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅰ/苏丹红Ⅲ的k分别为2.47、2.24，明显高于M-NMIPs对应的k，表明M-MIPs对苏丹红Ⅰ选择性较好。这是因为在M-MIPs中形成了与苏丹红Ⅰ空间结构和结合位点相匹配的空穴，而M-NMIPs由于其功能团的分布是无序的，未能形成与苏丹红Ⅰ互补的识别位点，对苏丹红Ⅰ不具特异选择性。

表1 聚合物的KD及k值Table 1 KDand kvalues of the polymers

2.7 方法的标准曲线与检出限

按照“1.4”的色谱条件进行测定，以峰面积A对浓度C进行线性回归分析。在加标浓度1.5～40 μg/g范围内，苏丹红Ⅰ峰面积 (A)与浓度(C)呈良好的线性关系，其线性回归方程为A=3.533C－6.024，相关系数(r)为0.989，方法的检出限(S/N=3)为0.50 μg/g。

2.8 辣椒粉提取液中苏丹红Ⅰ的测定

按照“1.4”方法用苏丹红Ⅰ M-MIPs和M-NMIPs分别对加标辣椒样品(加标浓度分别为2.4、4.8、19.2 μg/g)进行萃取处理，HPLC法测定。由表2可知，M-MIPs对应的回收率为78%～103%，相对标准偏差为2.8%～5.8%，其回收率明显高于M-NMIPs的回收率(8%～27%)，表明M-MIPs对苏丹红Ⅰ有特异识别性。

表2 实际样品中苏丹红Ⅰ的测定(n=3)Table 2 The detection of SudanⅠin paprika sample(n=3)

用 M-MIPs和 M-NMIPs对添加19.2 μg/g和未添加苏丹红Ⅰ的辣椒粉进行萃取，以富集后液相峰面积与富集前液相峰面积之比计算得M-MIPs的富集倍数约为6，图8为样品的HPLC色谱图。由图可以看出，实际样品中无苏丹红Ⅰ。

图8 辣椒粉样品(a)及加标辣椒粉样品(b、c)经吸附萃取后洗脱液的HPLC色谱图Fig.8 HPLC chromatograms for paprika samples(a)and spiked paprika samples(b，c)after extraction a，b:extracted with M-MIPs，c:extracted with M-NMIPs;spiked concentration of Sudan Ⅰ:19.2 μg/g

3 结论

本文以MPS修饰的Fe3O4为磁性组分，苏丹红Ⅰ为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，制备了磁性分子印迹聚合物。结合实验表明该磁性印迹聚合物对苏丹红Ⅰ有较高的选择性和吸附性。将该磁性印迹聚合物用于辣椒粉提取液中苏丹红Ⅰ的分离富集，用磁铁将其与溶液快速分离，并经高效液相色谱测得样品的回收率为78%～103%，相对标准偏差为2.8%～5.8%。

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