CD105与Ezrin蛋白在结直肠癌中的表达及临床意义

李宏伟，王铁山，熊正文，李 伟，黄 勇，胡海霞

近年来，随着人们生活水平提高和饮食习惯的改变，消化道肿瘤的发病率逐年增加。CD105是一种内皮细胞增殖标志物，在与肿瘤有关的新生血管内皮细胞中高度表达，是目前衡量内皮增殖状态比较准确的指标。Ezrin是影响黏附功能和肿瘤细胞恶性演进过程中的重要物质。Ezrin蛋白和肿瘤新生血管是近来临床研究热点，但其与结直肠癌的关系目前并不清楚。本研究依据光波/微波(Lightwave/Microwave，LW/MW)辐射热效应的原理，应用免疫组化 LW/MW-EnVisionTM法检测 CD105和Ezrin蛋白在结直肠癌组织中的表达，并对其与结直肠癌患者临床病理特征关系进行了分析，以期为判断结直肠癌的生物学行为和患者预后提供客观参考指标。

1 材料与方法

1.1 材料 收集解放军251医院病理科2006年12月—2010年12月手术切除结直肠癌标本100例，术前均未行放化疗。其中男57例，女43例;高/中分化腺癌73例，低分化腺癌27例;肿瘤未及浆膜层36例，浸润浆膜层64例;无淋巴结转移44例，有淋巴结转移56例。并取同期正常黏膜组织30例(远离癌组织4 cm以上)、腺瘤组织30例。所有标本按照常规石蜡切片、染色规范步骤操作。

1.2 试剂与主要仪器 鼠抗人CD105、Ezrin单克隆抗体、DAB显色液为福州迈新生物有限公司提供(均为即用型);EnVisionTM试剂盒为福州迈新生物有限公司提供。格兰仕WD900G LW/MW炉。额定输入功率:MW为1400 W，LW为1050 W;额定微波输出频率为2450 MHz;微波输出功率为900 W，分为微波、光波、光波/微波组合Ⅰ和光波/微波组合Ⅱ4种输出功能。

1.3 免疫组化染色方法 采用LW/MW-EnVisionTM法，微波输出功率分为5档调节，光波输出为单一光波管发光，采用LW/MW组合Ⅱ方法，参照文献［1］及试剂说明书操作。步骤如下:①石蜡切片常规脱蜡入水，用LW/MW 5档(输出功率90 W，下同)，PBS(pH7．4)洗 2 min，2 次;②抗原修复［2-3］:用微波 －枸橼酸钠缓冲液(0．01 mol/L，pH 6．0)做抗原修复，先用LW/MW 3档(输出功率150 W)修复抗原2 min，再用LW/MW 5档修复抗原5 min，2次，待自然冷却至近室温时自来水洗，PBS洗2 min，2次;③用LW/MW 5档，在甲醇－过氧化氢溶液中封闭内源性过氧化物酶2 min，PBS洗2 min，2次;④加一抗，LW/MW 5档5 min，PBS洗2 min，3次;⑤加聚合物增强剂，室温下孵育20 min，PBS洗2 min，3次;⑥加生物素化的羊抗兔IgG(1∶300)，37℃、30 min，LW/MW 5 档 5 min，PBS 洗 2 min，3次;⑦DAB-H2O2显色10 min;自来水终止显色;⑧苏木素复染0．5～1 min(用于图像分析的切片不作苏木素复染);⑨常规脱水、透明、封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定

1.4.1 CD105阳性:CD105阳性分布在血管内皮细胞胞质，呈阳性的血管多为新生薄壁、管径小的血管，大的厚壁血管未见CD105的表达。微血管计数方法［2-4］:以CD105为血管标记物的微血管计数，首先在低倍镜下(×40)扫描，寻找肿瘤内清楚的血管染色，且微血管密度(MVD)最高的区域(热点)，然后在 ×200倍镜(×20物镜和 ×10目镜，面积为0．739 mm2)下计数肿瘤内的毛细血管和小静脉数目，肿瘤硬化区和邻近正常结直肠组织内的微血管不作计数对象，只作内对照评价免疫组化染色。任何呈棕黄色的阳性内皮细胞或内皮细胞簇且与邻近血管、肿瘤细胞和其他结缔组织成分清楚分开即为一个能够计数的微血管。肌层较厚及血管管腔面积＞8个红细胞直径的血管均不计数。因为计数微血管的方法在观察者之间或观察者本人存在差异，所以在不同的时间计数3次，选择2次相同或相近数目的平均数。

1.4.2 Ezrin阳性判定:Ezrin阳性着色在肿瘤细胞膜和胞质内，阳性判定标准参考文献［5］。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13．0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 CD105标记的微血管计数结果 CD105表达于肿瘤组织内新生血管的内皮细胞胞质内，呈浅棕至深棕色(图1、2)。100例结直肠癌标本中微血管计数为(36．18±8．27)条，结直肠正常黏膜组织中未见CD105表达，结直肠腺瘤组织中微血管计数为(27．73±6．13)条，3组差异有统计学意义(P ＜0．01)。CD105标记的微血管与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关(P＜0．05)，见表1。

图1 结肠低分化腺癌新生及增生的微血管内皮CD105阳性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

图2 直肠腺瘤血管内皮CD105阳性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

图3 结肠低分化腺癌Ezrin蛋白阳性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

图4 结肠绒毛状腺瘤Ezrin蛋白阳性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

2.2 Ezrin蛋白表达 Ezrin蛋白表达于肿瘤细胞胞膜和胞浆，呈浅棕至深棕色(图3、4)。Ezrin蛋白在结直肠正常黏膜、结直肠腺瘤、结直肠癌组织表达阳性率分别是 23．3%(7/30)、50．0%(15/30)、72．0%(72/100)，三者表达阳性率依次增高，两两比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。Ezrin蛋白在100例结直肠癌组织中的阳性表达与浸润深度、淋巴结转移密切相关(P＜0．05);与其性别、年龄、分化程度、TNM分期无关(P＞0．05)，见表1。

表1 Ezrin、CD105蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系

2.3 Ezrin与CD105蛋白表达在结直肠癌组织中的关系 Ezrin蛋白阳性表达的72例结直肠癌中CD105标记的微血管计数为(38．21±6．38)条，明显高于Ezrin蛋白阴性表达的28例结直肠癌中CD105标记的MVD微血管计数为(34．74±8．59)条，两者存在一定的关联性(r=0．406，P＜0.01)。

3 讨论

丰富的血管可向肿瘤提供丰富的营养成分，有利于生长;而肿瘤细胞侵入血管内，易导致在其他部位生长形成远处转移灶;肿瘤中新生血管数量越多，越能够增加肿瘤的生长速度且发生转移的可能性大增。因此，肿瘤组织中血管的定量已被认为是一重要的独立的预后指标［6］。本研究结果显示，CD105标记的微血管在结直肠正常黏膜、腺瘤及结直肠癌间差异有统计学意义，且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关，与许多研究结果相似［7-10］。说明微血管在肿瘤的生长、浸润过程中起重要作用，同时也直接或间接表明抗新生血管治疗可抑制肿瘤的生长［11］。因此，检测肿瘤的微血管不仅可以评估患者的预后情况，并且可以为临床制定合理有效的肿瘤治疗、控制方案提供理论依据。

Ezrin蛋白为膜细胞骨架连接蛋白［12］，对细胞形态、分化、运动性和细胞与细胞、细胞与间质黏附有重要调节作用，通过调节肿瘤细胞黏附分子和信号转导等途径，参与细胞与细胞、细胞与间质的相互作用，影响肿瘤的浸润和转移［13-14］。有研究发现Ezrin蛋白的高表达与肿瘤的侵袭和转移有关［15-17］。而最近研究表明，存在持续活化状态Ezrin的细胞都伴有E-cadherin在细胞内的聚集，导致细胞连接的破坏，降低细胞间的黏附，使肿瘤细胞易于浸润转移。本研究发现，Ezrin蛋白在结直肠癌组织中的表达显著高于结直肠正常黏膜和结直肠腺瘤，且腺瘤与正常黏膜之间也存在显著差异，说明其可能在结直肠癌的发生、发展中也起着重要的促进作用，但具体机制有待进一步研究。同时Ezrin蛋白表达与结直肠癌浸润深度、淋巴结转移密切相关。这与一部分学者的研究结果相似［18-19］。Ezrin蛋白可能通过调节细胞黏附、肿瘤细胞信号转导等进而参与肿瘤浸润转移［20-22］。

在本实验中，通过结直肠癌中Ezrin蛋白的表达与CD105标记的微血管之间的关系发现，Ezrin蛋白表达阳性的结直肠癌中CD105标记的微血管计数明显高于阴性表达的结直肠癌组织。提示二者之间存在一定的关联性，Ezrin蛋白高表达可能促进肿瘤微血管的生成，但其机制尚不十分清楚。有研究认为这可能与Ezrin蛋白的高表达使膜上的转移相关信号通过与Rho蛋白相关的信号通路得到放大有关，后者可通过蛋白激酶信号转导通路促进肿瘤血管的生成，进而协助肿瘤细胞穿越脉管内皮向远处转移［23］。

［1］ 熊正文，曲延静，黄勇，等．光波－微波组合技术在肠道标本石蜡切片与免疫组化染色中的应用［J］．华北国防医药，2006，18(5):312-314．

［2］ Brown R W，Chiralae R．Utility of microwave-citrate retrieval in diagnostic immunohistochomistry［J］．J Mod Pathol，1995，8:515．

［3］ 许良中，杨文涛．免疫组织化学反应结果的判断标准［J］．中国癌症杂志，1996，6(4):229-231．

［4］ Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al．Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma［J］．J Natl Cancer Inst，1992，84(24):1875-1887．

［5］ 李荣杰，陶晓峰，贺岩，等．Ezrin、CD44在胃癌组织中的表达及其相关性［J］．肿瘤防治研究，2008，35(3):188-190．

［6］ 张江宇，王颀，朱彩霞，等．血管内皮标记物在乳腺癌演变中的表达及意义［J］．中华乳腺病杂志:电子版，2007，1(2):25-27．

［7］ 李宏伟，张海，黄勇，等．结直肠腺癌中CD105的表达及其临床病理意义［J］．山西医药杂志，2011(4):344-346．

［8］ 曲长萍，许宗兰，王渠源，等．宫颈癌血清CD105的水平及临床意义［J］．中华临床医师杂志:电子版，2012，6(13):3747-3748．

［9］ Wang X，Hershman D L，Abrams J A，et al．Predictors of survival after hepatic resection among patients with colorectal liver metastasis［J］．Br J Cancer，2007，97(12):1606-1612．

［10］ 巩有方，姜卫星，赵现斌，等．甲状腺乳头状癌组织中CD105的表达及其临床意义［J］．中国医药，2009，4(7):26-28．

［11］ Svagzdys S，Lesauskaite V，PavalkisD，et al．Microvessel density as new prognosticmarker after radiotherapy in rectal cancer［J］．BMC Cancer，2009，26(9):95．

［12］ 刘冀龙．胃癌组织芯片中Ezrin蛋白的表达及意义［J］．中国医药，2012，7(12):21-23．

［13］ 许俊龙，张杰，李玉红，等．早期胃癌组织 Ezrin和CD34表达及其临床病理学意义的探讨［J］．中华肿瘤防治杂志，2011，18(24):1942-1945．

［14］ 高辉，李庆昌．膜细胞骨架连接蛋白Ezrin与肿瘤侵袭转移相关性的研究现状［J］．中华肿瘤防治杂志，2009，16(21):1709-1713．

［15］ 孙静，田军，吴桂卿，等．Ezrin和Fascin在喉鳞状细胞癌组织中的表达及意义［J］．现代医药卫生，2012，28(3):339-342．

［16］ 田小林，蒋志庆，罗庆伟．RhoA和Ezrin蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义［J］．实用临床医药杂志，2010，15(1):111-114．

［17］ 潘立峰，吴敏兰，赵志荣，等．人胃癌组织中 Ezrin、ICAM-1的表达及意义的研究［J］．中国综合临床，2008，29(7):625-628．

［18］ Zhang Y，Hu M Y，Chen B H，et al．The influence of down regulation of ezrin expression by RNA interference on the growth and metastasis of heptocellular carcinoma:experiment in vitro［J］．Chin Med J，2006，86(8):530-534．

［19］ 张庆飞，杨兵．Ezrin和c-Met在胃癌组织中的表达及意义［J］．山西医科大学学报，2012，43(4):257-259．

［20］ 陈清勇，严杰，胡慧珍，等．不同转移潜能人肺癌细胞系Ezrin表达水平及微丝骨架差异性的研究［J］．中华肿瘤防治杂志，2011，18(13):1013-1016．

［21］ 米洋，岳卓立，李连贺，等．Ezrin和Inos在喉癌组织中的表达及其相关性研究［J］．疑难病杂志，2011，10(3):194-196．

［22］ 李春生．Mta-1与Ezrin在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其相关性［J］．中国现代医生，2010，48(28):4-5．

［23］ Pille J Y，Denoyelle C，Varet J，et al．Anti2RhoA and anti-RhoC siRNAs inhibit the p roliferation and invasiveness of MDA-MB2-31 breast cancer cells in vitro and in vivo［J］．Mol Ther，2005，11(2):267-274．