绿盲蝽胚胎发育的显微及切片观察

田彩红， 何 璠， 封洪强， 李国平， 邱 峰

（河南省农作物病虫害防治重点实验室，农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室，河南省农业科学院植物保护研究所，郑州 450002）

Bt棉的大面积种植有效控制了棉铃虫［Helicoverpa armigera（Hübner）］的发生为害［1］，棉田广谱性化学农药的使用量随之大幅度减少，而盲蝽种群发生数量剧增、为害加重，成为当前我国Bt棉上的首要害虫，并波及其他多种寄主植物。绿盲蝽［Apolygus lucorum （Meyer－Dür）］以滞育卵在枣、葡萄、桃、苹果、樱桃等寄主上越冬，滞育行为有效保证了绿盲蝽抵御冬季的不良环境。越冬代若虫孵化后刺吸为害果树的生长点和嫩叶，造成嫩芽畸形等症状，为害十分严重。因此，果树上越冬代绿盲蝽的初孵期就成为其防治的关键时期。研究绿盲蝽的胚胎发育及卵滞育发生的胚胎发育规律对于绿盲蝽的预测预报以及可持续防控具有重要实践意义。目前，对盲蝽的研究多集中在生物学特性、寄主适合度、发生规律、防控技术等方面［2－4］，而由于绿盲蝽将卵产于寄主植物的组织中，不便观察和研究，绿盲蝽的胚胎发育及滞育卵的胚胎发育规律尚不明确。

本文通过对绿盲蝽不同阶段胚胎发育的显微照相和石蜡切片制作，观察了滞育卵和非滞育卵胚胎发育动态，明确了其滞育卵发育的阶段胚胎发育特征，并测定了滞育卵和非滞育卵在其发育进程中的卵重变化，以期为早春绿盲蝽滞育卵孵化动态的预测预报提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

绿盲蝽的自然种群采自河南新乡原阳县河南现代农业研究开发基地（35°00′N，113°42′E）的 Bt棉田，以绿盲蝽人工饲料在（26±0.5）℃、80%RH 和L∥D＝16h∥8h的试验条件下继代饲养，建立非滞育种群。滞育卵采用光周期诱导的方式获得，即从1龄若虫开始饲养在L∥D＝8h∥16h的光周期下，成虫所产的卵为滞育卵［5］。在产卵期将铺有4层湿滤纸的培养皿放入养虫盒内让其产卵到滤纸上［6］并在（26±0.5）℃孵育。在卵孵育的第0（产卵当天）、1、2、3、4、5、6d，用灭菌蒸馏水浸润滤纸，用弯头镊子轻轻将卵剥出放入多聚甲醛固定液中固定，并做好标记，供石蜡切片使用。

1.2 不同发育时期胚胎的形态观察

在载玻片上滴一滴PBS缓冲液，将经多聚甲醛固定后的卵展着其上，利用 Motic（moticampro）昆虫解剖显微镜初步观察并拍照，选择具有典型特征的非滞育卵和滞育卵［7］，制作石蜡切片。

切片的制作方法由透射电镜切片的制作方法改良而来［8］，具体为：将固定好的绿盲蝽卵经70%、85%、95%、100%、100%乙醇，每级1h，梯度脱水；将脱水后的材料放入溶化的石蜡（56～58℃）溶液中，置于65℃烘箱中2h，取出换一次石蜡，再置于67℃烘箱中2h，之后取出用石蜡常规包埋。使用KD－2258－VI型石蜡切片机（浙江省金华科迪仪器有限公司）切片，切片厚度为5μm。之后贴片。贴片之前将新的盖片和载玻片放入95%乙醇内浸泡10min，蒸馏水冲洗干净后再放入95%乙醇中浸泡，然后用干净白布擦拭，手指不要接触玻面，为增加载玻片的黏附力，在载玻片上涂上一层甘油蛋白后用毛笔轻柔贴片。然后按以下步骤浸润：二甲苯浸润2次，每次10min。之后脱蜡：甲苯乙醇混合液（1∶1）浸润15min，100%乙醇浸润2次，每次5min，95%乙醇浸润5min，85%乙醇浸润5min，70%乙醇浸润5min，1%番红37℃恒温箱中浸润70min，70%乙醇浸润2次，每次1min，85%乙醇浸润2次，每次1min，95%乙醇浸润2次，每次1min，0.5%固绿浸润10s，100%乙醇浸润2次，每次1min，甲苯乙醇混合液（1∶1）浸润1min，二甲苯浸润2次，每次1min，中性红染色5min，乙醇盐酸分化（70%乙醇＋30%盐酸），并用中性红重染色；BA3000i显微镜（重庆光电仪器有限公司）观察照相，最后用中性树胶封片。

1.3 卵重的测定

取刚产下的卵100粒，用分析天平准确称其重量，称完后，放进温度为（26±0.5）℃，相对湿度约80%的恒温箱中使其继续发育，以后在每天相同时间点，在每片产卵的滤纸上喷布500μL的蒸馏水，称重一次，直至孵化为止［9］，各处理重复3次。数据分析利用SPSS13.0进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 绿盲蝽非滞育卵的胚胎发育

产卵后第0天：滞育卵表面浅绿色，细胞均匀排列（图1a），初产的绿盲蝽非滞育卵为乳白色，细胞周质及细胞均匀排列（图1b）。

产卵后第1天：卵经过24h的发育后，在盲蝽滞育卵内，细胞大小不一，没有胚带出现（图1c）。非滞育卵的纵切面，细胞呈现圆点状分散于卵中央部分的卵黄内，排列整齐，形成一层单细胞的囊胚层，里面胚带依稀可见（图1d）。

产卵后第2天：滞育卵的卵壳对光的通透性明显地低于非滞育卵壳的通透性，通过透射光，即使增大显微镜的光强，依然看不到滞育卵壳内的内容物。非滞育卵细胞层加厚，形成胚带。但是滞育卵体内细胞呈点状不规则分布，并有巨细胞出现，也可能为冰晶。细胞在形成单细胞的囊胚层后，随着细胞层的加厚，并没有形成胚带（图1e，图1f）。

产卵后第3天：胚胎头部正置于卵的前端，长条形的胚胎已经形成（图2a），腹部细长，明显分节，附肢已形成但尚未分节（图2b）。

产卵后第4天：原头变短，分节明显。腹部分节明显，中部膨大，端部略窄（图2c），红色眼点形成，头部向外突起（图2d）。

产卵后第5天：腹部各节的腹板划分明显。卵的整体外形变成弯香蕉型，卵壳发黑，红色复眼清晰可见（图2e和图2f）。

图1 绿盲蝽滞育卵和非滞育卵的胚胎发育（产卵后0～2d）Fig.1 Diapause and non－diapause egg embryonic development of Apolygus lucorum（0～2days after oviposition）

产卵后第6天：卵的整体变长，卵的颜色变成翠绿色，卵壳和胚体分离，卵的颈部变长拉伸，卵壳破裂（图2g），若虫孵出卵盖延伸变长成漏斗状（图2h）。

2.2 滞育卵的发育停滞期

为进一步明确滞育卵的胚胎发育阶段，切片观察发现：在产卵后48h滞育卵卵壳较厚，周质明确可见，细胞呈现不规则状排列，卵盖呈马鞍状（图3）。而非滞育卵切片可看到卵表皮层脱离胚盘，合核开始分裂并形成很多子核，胚带清晰可见，胚胎发育正在进行，进入了胚胎伸长阶段。

2.3 绿盲蝽发育过程中滞育卵和非滞育卵卵重的变化

绿盲蝽卵初产出时较轻，滞育卵每百粒重（2.6±0.66）mg，而非滞育卵每百粒重为（2.33±0.40）mg，两者重量相似，但是随着发育历期的延长，非滞育卵的重量和滞育卵的重量呈现不同的变化趋势（图4）。绿盲蝽非滞育卵从产出到孵出若虫的过程中，卵重不断在增加，至孵化时卵重增加了5倍多，但滞育卵重量基本保持不变（图4）。

图2 绿盲蝽非滞育卵的发育（产卵后3～6d）Fig.2 Non－diapause egg embryonic development of Apolygus lucorum（3～6days after oviposition）

3 讨论

越冬是绿盲蝽生活史中重要的组成部分，绿盲蝽以卵滞育的方式越冬，越冬期为每年9月中下旬至翌年4月上旬［10］。本研究通过切片观察和卵重测量，明确了绿盲蝽滞育卵停滞发育的时期。滞育卵在26℃下经过24h的胚胎发育，在形成单细胞的囊胚层后没有形成胚带，而且卵重不再增加，因此，可以确定绿盲蝽卵的滞育是发生在囊胚后期，即在26℃条件下产卵后第1天。据此推断滞育卵越冬后的发育历期应与非滞育卵历期相似或略短。因此在测报实践中，可以利用非滞育卵的有效积温和发育起点预测越冬卵的孵化时间。然而，室内低温解除滞育的试验却发现滞育解除后卵的发育历期明显长于非滞育卵［11－15］。这种滞育后发育历期的延长可能是由于低温条件未完全解除滞育所致，也有可能是绿盲蝽滞育卵越冬后存在一个与非滞育卵不同的胚胎发育阶段。因此，有必要对绿盲蝽的滞育后发育进行系统研究，以提高该害虫始发期预测的准确度。

昆虫的胚胎发育是一个复杂的过程，自精子经卵孔进入卵内，形成合核，经历卵裂、胚盘、胚带、胚层及胚膜的形成，至胚胎的分节、附肢的生成、体壁形成及背合等过程。目前关于昆虫胚胎发育的研究报道，大多数是对于膜翅目、鳞翅目，直翅目和脉翅目昆虫胚胎发育的研究［16－20］，而对半翅目昆虫胚胎发育研究较少。不少学者根据胚胎发育历期，人为地分为几个阶段，陈伟等详细描述了直翅目越北腹露蝗的胚胎发育过程，并将其分为10个阶段［21］。早在1966年，刘秀琼等对荔枝蝽象的胚胎发育进行了研究，通过石蜡切片法，把胚胎发育分为囊胚层形成，胚体伸长等13个阶段［9］。在本研究中，我们根据绿盲蝽卵在26℃下的发育历期，逐日描述了绿盲蝽的胚胎发育过程，为进一步研究绿盲蝽卵的滞育后发育奠定了基础。

滞育卵由于停止发育卵重保持恒重，而非滞育卵则由于发育过程中需要吸收水分卵重稳步上升。这与Constant等［22］观察到的一种盲蝽（Macrolophus caliginosus Wagner）的胚胎发育过程中鲜重不断增加的结果［22］一致。这是由于盲蝽的卵深埋在植物组织内，胚胎在发育过程中不断从植物组织内吸收水分，M.caliginosus卵的干重在孵化过程中没有变化，但鲜重却增加了一倍［22］。而在本研究中，绿盲蝽非滞育卵卵重增加了5倍多，因而，环境湿度成为绿盲蝽卵正常孵化的主要限制因子之一。而滞育卵由于其卵壳较非滞育卵卵壳厚，可能形成了像荔枝蝽象卵一样的较强的卵内环境保护机制［9］，从外界吸收的水分较少，有利于滞育卵度过不良环境。因此，春季降水比冬季降水对绿盲种群的影响更大，在测报实践中应重点寻找春季降水与发生期发生量之间的关系。

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