影响昆虫病原线虫共生菌发酵液杀虫活性相关因子研究

2013-09-28张奎花钱秀娟刘长仲

植物保护 2013年5期

张奎花，钱秀娟，刘长仲

（甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，兰州 730070）

昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类特殊细菌，与线虫互利共生。将线虫作为载体进入寄主昆虫体内，在昆虫血腔内大量繁殖，并产生抑菌物质和毒素，使寄主昆虫患败血症死亡；同时共生菌分解寄主组织，为线虫提供生长发育所需的营养物质；此外共生菌还产生抗生素，抑制其他杂菌的生长，为昆虫病原线虫提供理想的生长环境。目前，多种害虫如玉米螟、小菜蛾等对世界上使用量最大的微生物杀虫剂Bt产生抗性［1］，而转Bt抗虫基因植物的大面积推广应用将会加速抗性的发展，因此筛选和发掘新的微生物杀虫资源具有重要意义［2］。已有研究报道，Bowen［3］从发光杆菌（Photorhabdusluminescea）W－14菌株中分离纯化出一种对多种害虫具有胃毒作用的高分子量外毒素蛋白复合体，同时克隆出表达这些毒素蛋白的基因，使昆虫病原线虫共生细菌的研究成为人们关注的热点，并为开发新的杀虫基因和杀虫毒素蛋白提供了新途径［4］。昆虫病原线虫作为一种最具潜力的生物防治因子具有杀虫效果好、杀虫谱广、安全性高［5－8］等优点，研究其共生菌可以为开发研究新型微生物杀虫剂提供依据，为害虫生物防治提供新方法和新途径［9］。由于甘肃省特殊的地理环境，干旱少雨、海拔高、紫外线强，引进的昆虫病原线虫适应性较差［10］，本研究选用从甘肃省29个线虫种群中筛选的4个优良品系［11］中分离的共生菌，研究紫外灯、日光照射、不同温度及不同发酵时间等因子对大蜡螟5龄幼虫杀虫活性的影响，为研究开发新的杀虫基因及杀虫资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试共生菌

斯氏线虫［Steinernemakraussei（Steiner）］的0657L和0622L品系，S.affine（Bovien）的0664YM品系中分别分离得到嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdus）SKX0657、SKX0622和SAX0664；异小杆线虫［Heterorhabditismegidis（Poinar）］的0627M 品系分离得到发光杆菌（Photorhabdus）HMP0627，昆虫病原线虫由甘肃农业大学昆虫生态学实验室提供。

1.2 供试昆虫

大蜡螟（GalleriamellonellaLinnaeus）由甘肃农业大学昆虫生态实验室提供。

1.3 供试培养基

NA培养基：营养琼脂45 g，酵母提取物5 g，水1 000 m L。

鉴别培养基（NBTA）：营养琼脂45 g，红四氮唑（TTC）0.025g，溴百里酚蓝（BTB）0.04g，水1000mL。

TSY培养基：胰大豆肉汤40 g，酵母提取物5 g，蒸馏水1 000 m L。

1.4 共生菌的分离

用昆虫病原线虫侵染健康的大蜡螟5龄幼虫，16～24 h后分离共生细菌。用75%的乙醇给大蜡螟表面消毒，剪去第3对腹足顶端，将流出的含有共生菌的体液滴在NA培养基上，用接种针画线，倒置放在25℃恒温培养箱中培养［12］，24 h左右平板上出现单菌落，挑取单菌落接到NBTA平板上纯化，纯化后接入TSY培养液中，在180 r／min，25℃的恒温摇床上振荡培养48 h。取7 m L菌悬液、3 m L甘油，按这种配比将混合液分装在灭菌离心管中，放在－80℃的冰箱中保存［13］。

1.5 共生菌发酵液的制备

将保存的共生细菌画线于NA培养基上，25℃培养24～48 h，挑取单菌落，再画线于NBTA平板上，25℃培养24～48 h，挑取单菌落接入TSY培养基中，于180 r／min、25℃恒温摇床上振荡培养48 h，4℃保存备用。

1.6 不同温度对共生菌杀虫活性的影响

将活化的细菌发酵液以5%接菌量接入100 m L TSY培养液中，于180 r／min、25℃恒温摇床振荡培养48 h，将发酵液放于30、50、70、100 ℃水浴中，10 min后取出作为供试样，每一温度设同样处理的无菌发酵液为阴性对照（CK），并以未作任何处理的共生菌发酵液为阳性对照（常温25℃），以大蜡螟5龄幼虫为生测昆虫。称取1 g人工饲料放在60 mm培养皿中，将发酵液以100μL／g的比例与人工饲料混匀，每皿放一头饥饿24 h的大蜡螟5龄幼虫，每一供试样处理10头大蜡螟，重复3次。置于25℃恒温培养箱中，每隔24 h检查试虫的死亡情况，连续检查5 d，5 d后记录幼虫存活数，称活虫体重，计算校正死亡率和体重抑制率。其中，校正死亡率（%）＝（处理死亡率－对照死亡率）×100／（1－对照死亡率），体重抑制率（%）＝（对照试虫体重－处理试虫体重）×100／（对照试虫体重－初孵幼虫体重）。

1.7 紫外灯照射和日照对共生菌杀虫活性的影响

将装有100 mL发酵液的250 mL三角瓶培养48 h后，分别暴露于18 W紫外灯下30 cm处照射5、10、20、30、60、120 min和7月28日正午1.999 mmol／（m2·s）日光下照射1 h后作为供试样，每一个供试样为一个处理，每一处理设同样处理的无菌发酵液为对照，并以未作任何处理的共生菌发酵液为对照（常温25℃），以大蜡螟5龄幼虫为生测昆虫。按1.6的方法进行生物测定，每隔24 h检查幼虫死亡情况，5 d后记录存活虫的体重和数量，计算校正死亡率和体重抑制率。

1.8 不同培养时间对共生菌杀虫活性的影响

将活化的细菌发酵液以5%接菌量接入100 m L TSY培养基中，于180 r／min、25℃恒温摇床振荡培养48 h，每隔4 h取样，以不同培养时间的发酵液为供试样品，设无菌发酵液为对照。按1.6的方法进行生物测定，计算体重抑制率。

2 结果与分析

2.1 不同温度对共生菌杀虫活性的影响

不同线虫品系共生菌对大蜡螟胃毒活性存在显著差异（图1）。在常温下异小杆线虫共生菌HMP0627对大蜡螟的胃毒活性最高，平均校正死亡率为22.20%，平均体重抑制率为36.02%，显著高于其他共生菌。斯氏线虫共生菌SAX0664对大蜡螟也有较高的致死作用。

温度对共生菌的胃毒活性有显著影响。25℃下，各线虫品系共生菌对大蜡螟的平均体重抑制率和校正死亡率均最高，分别为28.05%～36.02%和4.44%～22.20%，显著高于其他温度处理。30℃处理10 min后，各线虫品系共生菌对大蜡螟5龄幼虫仍有较高的胃毒毒力；50℃处理后，各线虫品系共生菌对大蜡螟的校正死亡率明显下降，对大蜡螟的平均体重抑制率也比25℃和30℃有显著降低，其平均体重抑制率为9.73%～27.31%，仍对大蜡螟的生长有明显的抑制作用（表1）。70℃处理后，校正死亡率和体重抑制率均大幅度下降80%左右；100℃处理后，除HMP0627外，其他共生菌丧失胃毒毒力。此结果说明，4个线虫品系共生菌在50℃处理10 min后，仍有一定胃毒活性。

图1 不同种共生菌发酵液对大蜡螟的杀虫活性Fig.1 Insecticidal activity of the fermentation broth of different symbiotic bacteria to Galleria mellonella

表1 不同温度对共生菌杀虫活性的影响1）Table 1 Influence of temperatures on insecticidal activities of symbiotic bacteria

2.2 紫外灯照射和日照对共生菌杀虫活性的影响

由表2所示，日光照射和紫外灯照射对4个线虫品系共生菌的胃毒活性均有不同程度的影响。1.999 mmol／（m2·s）日光照射1 h后，除SKX0657外，其他3个共生菌对大蜡螟的校正死亡率分别由7.78%、22.2%和15.57%降到5.75%、18.24%和10.35%；各线虫品系共生菌的体重抑制率均显著低于未照射组（P＜0.05）。随着紫外灯照射时间的延长，4个线虫品系共生菌对大蜡螟5龄幼虫的校正死亡率呈逐渐下降的趋势。HMP0627、SAX0664和SKX0657照射10 min，SKX0622照射20 min时，对大蜡螟5龄幼虫的校正死亡率均显著低于未照射组（P＜0.05），体重抑制率在照射5 min时，除SKX0657和HMP0627外，其他两个共生菌与未照射组存在显著差异。紫外灯照射30 min之后，各线虫品系共生菌对大蜡螟的致死作用明显下降，但有明显的生长抑制作用；SKX0657在紫外灯照射60 min之后丧失杀虫活性。

表2 紫外灯照射和光照对共生菌杀虫活性的影响Table 2 Influence of ultraviolet ray and sunlight on insecticidal activities of symbiotic bacteria

2.3 不同培养时间对共生菌杀虫活性的影响

随着培养时间的延长，4个品系线虫共生菌的胃毒活性逐渐上升，但共生菌间存在差异。X0664和X0657对大蜡螟5龄幼虫的体重抑制率均小于SKX0622和HMP0627。SAX0664 在 24 h 时达到 41.70%；SKX0657在28 h时达到37.80%；而SKX0622则在36 h时达到最大值65.50%；HMP0627在40 h时达到最大值65.03%，并在24～40 h之间有较高的胃毒毒力。

图2 不同培养时间对共生菌胃毒活性的影响Fig.2 Influence of culture time on insecticidal activities of symbiotic bacteria against G.mellonella

3 结论与讨论

利用生物测定方法对影响昆虫病原线虫共生菌发光杆菌和嗜线虫致病杆菌发酵液杀虫活性的日光照射、紫外灯照射及温度等因子对大蜡螟5龄幼虫的胃毒活性进行研究。结果表明，未作任何处理的发光杆菌和嗜线虫致病杆菌共生菌发酵液对大蜡螟的胃毒活性存在显著差异，异小杆线虫共生菌HMP0627对大蜡螟的胃毒活性最高，校正死亡率和体重抑制率分别为22.20%和36.02%，斯氏线虫共生菌SAX0664对大蜡螟也有较高的致死作用。经过高温、日光及紫外灯照射后，各线虫品系共生菌虽有胃毒活性，但斯氏线虫共生菌的胃毒毒力明显低于异小杆线虫共生菌的胃毒毒力。日光照射1 h、紫外灯照射30 min时，各线虫品系共生菌仍有较高的胃毒毒力，HMP0627和SAX0664耐紫外线性较强，HMP0627优于SAX0664。经过50℃处理10 min后，HMP0627仍有较高的致死率和体重抑制率，SKX0657仍有较高的体重抑制率。不同线虫品系共生菌在不同培养时间对大蜡螟的胃毒毒力不同，HMP0627对大蜡螟的体重抑制率高于其他共生菌，并且持效时间长。因此进行发酵培养，应根据不同线虫品系共生菌选择合适的培养时间。

昆虫病原线虫共生菌杀虫活性物质主要有杀虫毒素蛋白、脂多糖类、次生代谢产物［1，15－17］，经过高温处理后，会破坏蛋白质的结构，使其杀虫活性受到影响。本研究结果表明，在50℃条件下，HMP0627对大蜡螟的平均体重抑制率为27.31%，仍有较高的胃毒毒力。该结果与前人研究结果基本一致，Jarrett从伯氏嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdusbovienii）中分离出杀虫毒素，这种毒素对鞘翅目、鳞翅目的多种昆虫有毒杀作用，在50℃时依旧很稳定［14］。王欢利用生物测定对28个线虫品系的152个共生菌菌株进行研究，50℃处理10 min对高毒力菌株的杀虫活性无明显影响［9］。温度升高及处理时间延长可能会影响线虫共生菌的杀虫活性。

日光照射和紫外灯照射对大蜡螟杀虫活性的影响不仅与照射时间有关，而且不同线虫品系共生菌杀虫活性也不同。照射30 min后，各线虫品系共生菌仍有胃毒活性，这与前人研究结果存在差异，孟亚莉利用生物测定对35株共生菌菌株进行研究，高毒力菌株经紫外灯照射60 min后有胃毒毒力［1］。但其胃毒活性明显小于HMP0627、SKX0622和SAX0664经过紫外照射120 min的胃毒活性，这与甘肃省的特殊地理环境海拔高、紫外线强等有关。有关紫外照射对共生菌杀虫活性影响的研究报道很少，究竟紫外照射还改变了哪些物质的特性有待进一步研究。本研究的供试菌株从甘肃省优良线虫品系中分离得到，因此有必要将其产生的物质进行鉴定和编码基因，为研制开发新的微生物杀虫剂及转基因抗虫植物提供理论基础和基本数据，为害虫生物防治提供新方法和新材料。

［1］孟亚莉，丛斌，王欢，等.昆虫病原线虫共生菌对玉米螟幼虫的杀虫活性［J］.沈阳农业大学学报，2004，35（2）：97－100.

［2］俞志华.抗虫基因的抗虫机理及其应用现状和展望［J］.生物学通报，2000，35（7）：8－10.

［3］Bowen D，Rocheleau T A，Blackburn M，et al.Novel insecticidal toxins from the bacteriumPhotorhabdusluminescens［J］.Science，1998，280（26）：2129－2132.

［4］王永宏，张强，张兴.2株昆虫病原线虫共生菌发酵物杀虫活性研究［J］.西北农林科技大学学报，2009，37（6）：166－170.

［5］王进贤，邱礼鸿，刘镇明.格氏线虫对高等动物的安全性：I对小白鼠的安全测试［J］.昆虫天敌，1983，5（1）：39－41.

［6］王进贤，刘镇明.格氏线虫对高等动物的安全性：Ⅱ对家兔的敏感性试验［J］.昆虫天敌，1983，5（4）：240－242.

［7］王进贤，黄进同，陈乾生.格氏线虫对高等动物安全性试验：Ⅲ对猕猴的安全测试［J］.昆虫天敌，1984，6（1）：41－42.

［8］谷黎娜，钱秀娟，刘长仲，等.甘肃省昆虫病原线虫3个优良品系的生物学特性研究［J］.甘肃农业大学学报，2009，44（2）：85－89.

［9］王欢，丛斌，董辉，等.共生菌高毒力菌株的筛选及其抗逆性的研究［J］.沈阳农业大学学报，2007，38（1）：49－53.

［10］邢玉芳，钱秀娟，刘长仲.甘肃省昆虫病原线虫抗干燥能力测定［J］.贵州农业科学，2009，37（1）：90－91.

［11］谷黎娜.甘肃省昆虫病原线虫区系及优良品系生物学特性研究［D］.兰州：甘肃农业大学，2008.

［12］徐洁莲.昆虫病原线虫发光杆菌的分离与鉴定［J］.昆虫天敌，1986，8（3）：168－174.