附子不同炮制方法比较分析△
2013-09-26周林任玉珍杜杰张晓莉金锋
周林,任玉珍,杜杰,张晓莉,金锋
(1.中国药材公司中药质量控制技术国家工程实验室,北京 100195;2.北京中医药大学中药学院,北京 100102;3.四川江油中坝附子科技发展有限公司,四川 江油 621700;4.河南中医学院,河南 郑州 450008)
附子不同炮制方法比较分析△
周林1,2*,任玉珍1,杜杰1,张晓莉3,金锋4
(1.中国药材公司中药质量控制技术国家工程实验室,北京 100195;2.北京中医药大学中药学院,北京 100102;3.四川江油中坝附子科技发展有限公司,四川 江油 621700;4.河南中医学院,河南 郑州 450008)
目的:采用高效液相色谱法分析附子不同炮制品中6个生物碱的含量,研究《中国药典》炮制法、蒸制法、炒制法之间的差异。方法:采用《中国药典》2010年版附子含量测定项下方法检测;运用SPSS17.0统计分析软件进行数据处理。结果:各成分分离良好;蒸附片、炒附片、黑顺片、白附片、淡附片、炮附片中双酯型生物碱的量都得到有效降低,但蒸附片和炒附片中单酯型生物碱的含量明显增加。结论:蒸制法、炒制法与《中国药典》炮制法一样,具有相同的炮制减毒能力,但蒸制法和炒制法又能增加毒性小、疗效好的单酯型生物碱类的量,优于《中国药典》炮制法。
附子;炮制;高效液相色谱法;含量比较
附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根。具有回阳救逆,补火助阳,散寒止痛的功能[1]。附子中主要含乌头类生物碱,是有效成分,也是毒性成分,为保证其临床疗效和安全应用,须经炮制才能使用。附子炮制减毒的方法早在汉代就有记载,历代医药专著中有炮、炒、煨、蒸、煮等炮制方法。在国家标准方面,自《中国药典》1963年版[2]起即收载了附子4个饮片规格黑顺片、白附片、淡附片、炮附片的炮制方法。除了《中国药典》炮制法(《药典》法)之外,附子采用蒸制法和炒制法进行炮制减毒在历代本草专著中也有记载,如清代《握灵本草》[3]中有“去皮蒸过”,元明时期《寿世保元》、《医学纲目》记载了附子“炒”[4-5]。临床应用附子饮片中,部分老中医认为《药典》法中附子浸泡胆巴溶液后有效成分损失殆尽,与《景岳全书》[6]、《本草问答》[7]、《本草从新》[8]、《本草正义》[9]等表述的观点相一致,并主张采用蒸制法和炒制法对附子进行炮制减毒。作者采用《中国药典》2010年版附子项下生物碱含量测定方法[1],考察《药典》法、蒸制法和炒制法在炮制附子方面的作用,运用SPSS统计软件分析不同炮制方法的差异性。经研究发现,蒸制法、炒制法与《药典》法一样,具有相同的炮制减毒能力,但蒸制法和炒制法又能增加毒性小、疗效好的单酯型生物碱类的量,优于《药典》法。
1 仪器、试剂与材料
Waters 2695高效液相色谱仪,2998二极管阵列检测器;DENVER电子分析天平(十万分之一,北京赛多利斯仪器系列有限公司);KQ-251DA数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,功率300 W,频率40 kHz)。乙腈、四氢呋喃为色谱纯(Fisher公司),异丙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、醋酸铵、三氯甲烷为分析纯(北京化学试剂公司)。
对照品:乌头碱(110720-200410)、次乌头碱(110798-200404)、新乌头碱(110799-200404)、苯甲酰次乌头原碱(111796-200901)、苯甲酰乌头原碱(111794-200901)、苯甲酰新乌头原碱(111795-200901),购自中国食品药品检定研究院。
黑顺片(批号:H060801~H060809,H100614,H100827,H110820,H110801)、白附片(批 号:B030905~B030907,B030909,B110301)、淡附片(批号:D080901~D080907)、炮附片 (批号:P080904~P08097):四川江油中坝附子科技发展有限公司根据《药典》炮制方法生产。
蒸附片(批号:C111001~C111005,C120301~C120305):取生附片5kg,投入蒸制容器内,常压蒸制,至出现油面光泽,低温干燥。
炒附片(批号:Z120301~Z120310):取河砂投入炒锅内,炒至滑利状态,投入净生附片5kg,炒至外表深棕黄色,断面棕黄色,取出迅速筛去砂子,放凉。
蒸附片、炒附片均为四川江油中坝附子科技发展有限公司试生产样品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
根据《中国药典》2010年版附子含量测定项下液相条件,选择Waters SunfireTMC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);以乙腈 -四氢呋喃(25∶15)为流动相A,以0.1mol·L-1醋酸铵溶液(每1 000mL加冰醋酸0.5mL)为流动相B,梯度洗脱,0~48min,15%~26%A;48~49min,26%~35%A;49~58min,35%A;58~65min,35%~15%A。检测波长:235nm;柱温:30℃;流速:0.8mL·min-1;进样量:10μL。
2.2 对照品溶液的制备
取各对照品适量,精密称定,用异丙醇-三氯甲烷(1∶1)溶液溶解,配制成质量浓度分别为苯甲酰新乌头原碱0.021 5mg·mL-1、苯甲酰乌头原碱0.016 9mg·mL-1、苯甲酰次乌头原碱 0.015 0mg·mL-1、新乌头碱 0.013 2mg·mL-1、次乌头碱0.010 9mg·mL-1、乌头碱 0.011 1mg·mL-1的对照品储备液,储存于4℃冰箱待用。
2.3 供试品溶液的制备
取附子各炮制品粉末(过三号筛)约2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加氨试液3mL,精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50mL,称定重量,超声处理(功率300 W,频率40 kHz,水温在25℃以下)30min,放冷,再称定重量,用异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液25mL,40℃以下减压回收溶剂至干,残渣精密加入异丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液3mL溶解,滤过,取续滤液,即得。
2.4 样品检测结果
按照《中国药典》规定的含量检测方法,检测48批附子饮片的6种生物碱含量,见表1。计算3种双酯型生物碱和3种单酯型生物碱总和,结果发现,《药典》法、炒制法、蒸制法炮制的48批附片都完全符合标准。混合对照品(A)、生附片(B)HPLC图见图1。
表1 附子样品含量测定结果(n=2)/%
续表1
图1 混合对照品(A)、生附片(B)HPLC图
2.5 不同炮制方法炮制的样品生物碱类成分聚类分析
分别对生附片、黑顺片、白附片、淡附片、炮附片、蒸附片、炒附片所检测的3种单酯型生物碱含量和3种双酯型生物碱含量进行聚类分析。分析结果显示,54批样品共分为3组,未炮制(生附片)归为一组,命名为group 1;《药典》法炮制的饮片(黑顺片、白附片、淡附片、炮附片)归为一组,命名为group 2;蒸制法(蒸附片)、炒制法(炒附片)归为一组,命名为group 3。
2.6 不同炮制方法炮制的样品中双酯型生物碱类成分分析
根据聚类分析结果,分别对每2组的新乌头碱、次乌头碱、乌头碱含量和双酯型生物碱总和进行非参数检验。结果见表2。
表2 3组样品双酯型生物碱比较分析P值
从统计分析结果显示,蒸制法、炒制法和《药典》法炮制的附子样品与生附片中3种双酯型生物碱含量和双酯碱总和差异有统计学意义,即3种双酯型生物碱含量都下降明显(P<0.05);而蒸制法、炒制法与《药典》法炮制的附子样品中双酯型生物碱含量和双酯碱总和差异无统计学意义(P>0.05),即不能认为蒸制法、炒制法与《药典》法炮制减毒的效果不相同。
2.7 不同炮制方法炮制的样品中单酯型生物碱类成分分析
根据聚类分析结果,分别对每2组的苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱含量和单酯型生物碱总和进行非参数检验。结果见表3。
表3 3组样品单酯型生物碱比较分析P值
从统计分析结果显示,《药典》法炮制的饮片(黑顺片、白附片、淡附片、炮附片)与生附片相比较,不能认为苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、单酯型生物碱总和的量与对应的生附片中不同(P>0.05),只有苯甲酰次乌头原碱含量差异有统计学意义(P<0.05),综合分析可知,《药典》法炮制后饮片中单酯型生物碱的量与生附片中的量基本相同。
蒸制法、炒制法炮制的样品与生附片、《药典》法炮制的饮片(黑顺片、白附片、淡附片、炮附片)中3种单酯型生物碱含量及单酯碱总和差异有统计学意义(P<0.05),即炒制法、蒸制法炮制的样品中3种单酯型生物碱含量及总和明显高于《药典》法和生附片。
3 结论
通过测定附子中双酯型和单酯型6种生物碱含量,附子炮制后双酯型生物碱含量显著下降,蒸制法、炒制法和《药典》法促进双酯类生物碱向单酯类生物碱转化的能力相同(减毒),蒸附片、炒附片、黑顺片、白附片、炮附片、淡附片中3种双酯型生物碱含量均无明显差异,从分析结果可以认为,《药典》法与蒸制法、炒制法在炮制减毒作用方面是相同的。
蒸制法、炒制法与《药典》法炮制的附片中保留苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱等药效成分的效果不同,蒸附片和炒附片中3种单酯型生物碱含量明显增加(增效),而黑顺片、白附片、炮附片、淡附片中3种单酯型生物碱含量与生附片基本一致。双酯型生物碱毒性大,《中国药典》2010年版将其作为限量检查指标成分,而单酯型生物碱疗效好、毒性小,定为含量测定指标,其毒性是新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的1/200[10-12]。蒸附片和炒附片3种单酯型生物碱含量明显高于黑顺片、白附片、炮附片、淡附片,推测是临床疗效优于《药典》法的主要原因。
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Com parative Analysis of Different Processing M ethods in Aconiti Lateralis
ZHOU Lin1,2*,REN Yu-zhen1,DU Jie1,ZHANG Xiao-li3,JIN Feng4
(1.China National Corp.of Traditional&Herbal Medicine,Beijing 100195,China;2.Beijing University of ChineseMedicine,Beijing 100102,China;3.Sichuan Jiangyou Zhongba T&SDevelopment Co.LTD of Aconite Lateralis Praeparata,Jiangyou 621700,China;4.Henan University of TCM,Zhengzhou 450008,China)
Objective:By simultaneous quantification of 6 aconitum alkaloid compounds in Aconiti Lateralis to compare the differences from the different processing methods.M ethods:The method of aconitum alkloids in Aconiti Lateralis is according to Chinese Pharmacopoeia(2010 ed).Data is carried out by SPSS 17.0 statistical analysis software.Results:The 6 compounds were separated clearly.The amount of diester-type aconitum alkaloid compounds have been effectively reduced by pharmacopoeia method,steamed method and frying method,but the monoester-type aconitum alkaloid content in zhengfupian and chaofupian was significantly increased.Conclusion:Pharmacopoeiamethod,steamed method and fryingmethod have the same processing attenuated ability.The contents ofmonoester-type aconitum alkaloid,which had low toxicity and high curative effect,are increased greatly in using the last twomethods,better than the pharmacopoeiamethod.
Radix Aconiti Lateralis;Processing;HPLC;Comparison of aconitum alkaloid
2012-07-06)
中医药行业科研专项——附子等中药炮制方法传承与规范化应用研究项目 (201107008)
*[通讯作者]周林,Tel:(010)61252955,E-mail:zhoulin415@163.com