丹鹿通督片质量标准的研究

李海燕，赵雪艳

(1.河南省食品药品检验所，河南郑州450003;2.河南羚锐制药股份有限公司，河南信阳464000)

丹鹿通督片由丹参、鹿角胶、黄芪、延胡索、杜仲等药材组成，具有活血通督、益肾通络的功效，用于腰椎管狭窄症(黄韧带增厚、椎体退行性改变、陈旧性椎间盘突出)属瘀阻督脉型所致的间歇性跛行、腰腿疼痛、活动受限、下肢酸胀疼痛、舌质暗或有瘀斑等症的治疗。丹鹿通督片收载于《卫生部药品标准新药转正标准》［1］第85册，原标准操作较繁琐，且不能对药品进行有效质量控制。笔者根据处方所含药味的化学成分及剂型特点，研究修订了丹参、黄芪的薄层色谱鉴别，修订了黄芪中黄芪甲苷［2］的含量测定方法，全面提高了质量标准，以便更好地控制药品质量。

1 药品、试剂与仪器

丹鹿通督片，河南羚锐制药股份有限公司产品，批号 1202201，1202202，120214。丹参、黄芪、延胡索对照药材(批号依次为 120923－200610，120974 －200609，120928－200604)及丹参酮ⅡA、延胡索乙素对照品(批号依次为110766－200518，110726－200610)、黄芪甲苷对照品(批号110781－200613，供含量测定用)，均由中国药品生物制品检定所提供;甲醇、乙腈为色谱纯;水为乐百氏纯净水;其他试剂均为分析纯。Waters 2690高效液相色谱仪－蒸发光散射检测器(Alltech ELSD 2000ES)，产地美国;硅胶G预制薄层板，青岛海洋化工厂产品;KQ－300型超声波清洗机，功率 250 W，频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 丹 参

方法参照文献［3］。取本品研细，称取2 g，加乙醚20 mL，超声提取20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取处方中除丹参外的其他药物，按丹鹿通督片制备工艺制备，制成缺丹参阴性对照药，同法制成缺丹参阴性对照溶液。另取丹参对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。再取丹参酮ⅡA对照品，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)—乙酸乙酯(10∶2)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点;缺丹参阴性对照品色谱中，在相对应的位置无干扰。见图1。

图1 丹参薄层鉴别色谱图

2.1.2 黄 芪

方法参照文献［4］。取本品20片，除去包衣，研细，称取2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中;精密加入甲醇50 mL，称定质量;加热回流2 h，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量;摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干;残渣加水30 mL微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液;用氨试液洗涤2次，每次50 mL;弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL，摇匀，作为供试品溶液。取处方中除黄芪外其他药物，按丹鹿通督片制备工艺制成缺黄芪阴性对照药，同法制成缺黄芪阴性对照溶液。另取黄芪对照药材1 g，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μL、对照药材及对照品溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－丙酮－水(5∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以体积分数10%硫酸乙醇溶液，置105℃烘至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，缺黄芪阴性对照色谱中，在相对应的位置无干扰。见图2。

图2 黄芪薄层鉴别色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为 Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，柱温为 35 ℃，流动相为乙腈 － 水(34∶66)［5］，体积流量为 1 mL/min，载气体积流量2.3 L/min，供试品进样体积 15 μL，对照品进样体积10 μL 及 20 μL，蒸发光散射检测器漂移管温度105℃。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于6 000。色谱见图3。

2.2.2 溶液的制备

对照品溶液:取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1毫升含0.2 mg的溶液，即得。供试品溶液:取2.1.2项下的供试品溶液作为供试品溶液。阴性溶液:按丹鹿通督片处方中比例称取除黄芪外的其他药物，按丹鹿通督片制备工艺制备缺黄芪阴性对照药，按供试品溶液制备方法制得缺黄芪阴性对照品溶液。

图3 丹鹿通督片高效液相色谱图

2.2.3 线性关系考察

精密吸取黄芪甲苷对照品溶液(0.195 5 g/L)5，7，10，15，25，30 μL，按上述色谱条件测定。以进样量(X，μg)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=2 044 106.882X－1 305 814.604(r=0.999 3)。结果表明:黄芪甲苷在0.977 5 ～5.865 0 μg 线性良好。

2.2.4 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，进样10 μL，重复进样6次，结果黄芪甲苷峰面积的RSD为2.2%。

2.2.5 重复性试验

取同一批样品(批号为120214)，平行制备6份供试品溶液，测定黄芪甲苷的含量，结果RSD为2.0%，表明重复性良好。

2.2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件分别于0，2，4，6，8，10 h 注入液相色谱仪，测定黄芪甲苷峰面积积分值。结果示峰面积的RSD为2.6%，表明供试品溶液在10 h内基本稳定。

2.2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的本品(批号为120214，黄芪甲苷含量1.028 8 mg/g)约1 g，精密加入质量浓度为0.977 4 g/L的黄芪甲苷对照品甲醇溶液1 mL，再精密加入甲醇溶液50 mL，按2.2.3项下方法制备加样供试品溶液。精密吸取对照品溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定黄芪甲苷含量，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.2.8 样品含量测定

按2.2.3项下方法制备供试品溶液，测定3批丹鹿通督片中黄芪甲苷的含量，平行测定2次，结果见下表2。

表2 3批样品黄芪甲苷含量测定结果

3 讨论

验证原标准中的薄层色谱，结果发现:丹参、杜仲［6］色谱效果不理想，黄芪薄层色谱操作复杂。笔者把丹参色谱中展开剂改为石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯(10∶2)，结果Rf值适中，薄层效果较好;把黄芪色谱中供试品溶液的制备方法改为与修订后的含量测定方法一致，结果简化了操作过程且薄层效果较好;对杜仲［7］的薄层色谱进行了多种提取方法的研究，结果均不理想，建议删去杜仲的薄层色谱项;验证了原标准中延胡索的薄层色谱检查，原方法薄层效果较好，未改动。采用HPLC-ELSD法进行了黄芪中黄芪甲苷［8］的含量测定，丰富了药品的定性定量指标，比较了原标准中TLCS法与HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量，结果HPLC-ELSD法测定的黄芪甲苷含量比TLCS法测定的含量高10%以上，提取较完全，提取方法简便可控，可确保药品的安全有效性。

在丹鹿通督片含量测定研究过程中，曾比较了超声提取、加热回流及索氏提取等不同方法制备供试品溶液，结果超声提取不能提取完全，回收率不符合规定，而加热回流比索氏提取操作简便，因此选用加热回流的方法制备供试品溶液。考察了供试品提取过程中氨试液洗涤的时间不同，黄芪甲苷含量差别较大的问题，结果发现用氨试液洗涤，每次洗涤时间在2 h以上时，黄芪甲苷提取完全且含量稳定。

［1］中华人民共和国卫生部.卫生部药品标准新药转正标准:第85册［S］.1997:92.

［2］高建，夏泉，黄赵刚，等.HPLC-ELSD同时测定当归补血总苷中黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ［J］.中成药，2012，34(2):268.

［3］郑黎花，张慧，张利.川产丹参炒制工艺优选及其质量标准［J］.中国实验方剂学杂志，2012，5(3):20.

［4］汪祺，张聿梅，戴忠，等.黄芪中氨基酸、黄酮类成分的特征薄层图谱鉴别［J］.中国药事，2012，26(1):50.

［5］汪冰，尤慧莲，徐丽华.HPLC法测定芪参胶囊中5种化学成分［J］.中成药，2012，33(3):483.

［6］陈彩娟，沈舒，肖同书，等.杜仲化学成分研究［J］.亚太传统医药，2012，8(3):25.

［7］李欣，刘严，朱文学，等.杜仲的化学成分及药理作用研究进展［J］.食品工业科技，2012，33(10):378.

［8］韩景兰，李太红.复方紫贝液质量标准的研究［J］.中医研究，2007，20(12):10.