当归多糖对衰老模型小鼠抗氧化作用及p16蛋白表达水平的影响

安方玉，刘雪松，李雪燕，关德凤，梁健庆，张艳霞

(1.甘肃中医学院，甘肃 兰州730000;2.甘肃中医学院附属医院，甘肃兰州730000)

衰老又叫老化，是随着年龄增加自身机能减退，结构及组分进行性退变的一种病理现象［1］。机体衰老时，常常会引起细胞增殖功能低下、蛋白酶活性下降等，最终导致脏器萎缩、功能低下［2］。已有研究证实:当归多糖作为当归的有效成分之一，具有抗肿瘤、抗炎、增强免疫力、延缓衰老、治疗老年痴呆等广泛药理作用［3－4］。本研究联合D－半乳糖和亚硝酸钠制备小鼠衰老模型，观察小鼠脑组织中p16蛋白的表达、单胺氧化酶(MAO)的活性变化，肝组织及肾组织中MAO和过氧化氢酶(CAT)的活性变化，以期为当归延缓衰老提供理论和实验依据，并为中药治疗老年病的研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 动 物

清洁级昆明种小鼠60只，雌雄各半，体质量(20±2)g，由甘肃中医学院科研动物中心提供，动物质量合格证号:SCXK(甘)2011－0001－0001126。

1.2 药品、试剂与仪器

当归多糖，陕西慈缘生物技术有限公司产品，批号CY110320，用生理盐水配制成10 g/L的储备液，备用。D－半乳糖，北京化学试剂公司产品，批号020123，临用前用生理盐水配制成12 g/L备用;亚硝酸钠，西安化学试剂厂产品，批号860723，临用前用生理盐水配制成9 g/L备用;MAO测定试剂盒(批号20120715)、CAT试剂盒(批号20120725)、考马斯亮蓝测定试剂盒(批号20120816)，均由南京建成生物工程研究所提供;p16 ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司产品，批号20120825。SK3300H型数控超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司产品;VIS－723N型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司产品;BS224S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品;HH－4数显恒温水浴锅，郑州杜甫仪器厂产品;XYJ80－20型离心机，金坛市恒丰仪器厂产品;XW－80A型旋涡混匀器，上海精科实业有限公司产品;ZY12306型微量加样器，德国BRAND公司产品;DG3022型酶联免疫检测仪，华东电子管厂产品。

1.3 动物分组、给药与模型的建立

将60只小鼠按照随机数字表法随机分为空白对照组，模型对照组，当归多糖低、中、高剂量组，脑复康组6组，每组10只。采用灌胃给药法，当归多糖高、中、低剂量组分别按照 400，200，100 μg/g 剂量给药［4］，脑复康组按照 200 μg/g剂量给药，模型对照组及空白对照组灌服等体积的生理盐水。给药同时，模型对照组，当归多糖高、中、低剂量组，脑复康组每日腹腔注射D－半乳糖120 μg/g和亚硝酸钠 90 μg/g 各 0.2 mL［4－5］，空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水，治疗8周。

1.4 检测指标

8周后，眼球采血处死小鼠，取其大脑、肝、肾组织用冷生理盐水冲洗后备用。

1.4.1 脑组织生化指标

用电子天平称量脑组织，用生理盐水按1∶9的比例稀释成100 g/L脑匀浆，采用普通离心法，3 000 r/min离心10 min，以微量加样枪吸取上清液待用。利用苄胺作为底物，在MAO作用下，生成产物苄醛，用环己烷提取，测定242 nm处的吸光度值，计算MAO的活力。酶蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。p16蛋白含量的测定采用ELISA检测法。操作步骤按照试剂盒的操作说明执行。

1.4.2 肝组织生化指标

用电子天平称量肝组织，用生理盐水按照1∶9的比例稀释成100 g/L肝匀浆，采用普通离心法，3 000 r/min离心10 min，以微量加样器吸取上清液待用。MAO活力的测定方法同1.4.1。利用 CAT在一定条件下可以分解底物过氧化氢(H2O2)，使H2O2在反应体系中的浓度逐渐降低，吸光度也逐渐降低，利用紫外分光光度法在240 nm处测定OD1和OD2值，计算出CAT的活力。酶蛋白含量的测定方法同1.4.1。操作步骤按照试剂盒的操作说明执行。

1.4.3 肾组织生化指标

用电子天平称量肾组织，用生理盐水按照1∶9的比例稀释成100 g/L肾匀浆，采用普通离心法，3 000 r/min离心10 min，以微量加样器吸取上清液待用。MAO活力的测定方法、酶蛋白含量的测定方法同1.4.1。CAT 活力的测定方法同 1.4.2。操作步骤按照试剂盒的操作说明执行。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠脑组织p16蛋白表达对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠脑组织p16蛋白表达增加，差别有统计学意义(P＜0.01)。当归多糖各剂量组脑组织p16蛋白的表达较模型对照组降低，以中、高剂量组明显，差别有统计学意义(P ＜0.05或 P＜0.01);但与脑复康组对比，差别无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组小鼠脑组织p16蛋白表达对比 ±s

表1 各组小鼠脑组织p16蛋白表达对比 ±s

注:与空白对照组对比，＊＊P＜0.01;与模型对照组对比，#P＜0.05，##P ＜0.01。

组 别 动物数 剂量/(μg·g－1) p16/(μg·L－1)10 4.12 ±0.56模型对照组 10 7.91 ±0.60＊＊脑复康组 10 200 5.12 ±0.53##当归多糖低剂量组 10 100 7.09 ±0.31#当归多糖中剂量组 10 200 5.82 ±0.59##当归多糖高剂量组 10 400 4.71 ±0.62空白对照组##

2.2 各组小鼠脑组织MAO活性对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠脑组织MAO的活性升高，差别有统计学意义(P＜0.01)。当归多糖各剂量组脑组织MAO活性较模型对照组下降，以中、高剂量组明显，差别有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);但与脑复康组对比，差别无统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

表2 各组小鼠脑组织MAO活性对比 ±s

表2 各组小鼠脑组织MAO活性对比 ±s

注:与空白对照组对比，＊＊P ＜0.01;与模型对照组对比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组 别 动物数 剂量/(μg·g－1) MAO/(U·mgprot－1)10 6.34 ±1.10模型对照组 10 8.32 ±2.45＊＊脑复康组 10 200 3.34 ±0.34##当归多糖低剂量组 10 100 6.70 ±0.71#当归多糖中剂量组 10 200 3.61±0.86＊＊##当归多糖高剂量组 10 400 2.19 ±2.01＊＊##空白对照组

2.3 各组小鼠肝组织MAO活性和CAT活性对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠肝组织MAO活性升高、CAT活性下降，差别有统计学意义(P＜0.01)。当归多糖各剂量组与模型对照组对比，肝组织MAO的活性虽降低但差别无统计学意义(P＞0.05)、CAT活性升高且差别有统计学意义(P ＜0.05或 P＜0.01);但与脑复康组对比，差别无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 各组小鼠肝组织MAO活性和CAT活性对比 ±s

表3 各组小鼠肝组织MAO活性和CAT活性对比 ±s

注:与空白对照组对比，＊＊ P ＜0.01;与模型对照组对比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组 别 动物数 剂量/(μg·g－1) MAO/(U·mgprot－1) CAT/(U·gprot－1)6.17 ±1.01 363.54.74 ±89.30模型对照组 10 10.26±2.04＊＊ 175.02±55.94＊＊脑复康组 10 200 8.34 ±1.31 309.74 ±25.93##当归多糖低剂量组 10 100 9.92 ±2.53 234.35 ±25.89＊＊#当归多糖中剂量组 10 200 8.78 ±1.37 278.75 ±47.73＊＊##当归多糖高剂量组 10 400 7.19 ±2.21 347.94 ±41.21空白对照组10##

2.4 各组小鼠肾组织MAO活性及CAT活性对比

与空白对照组对比，模型对照组小鼠肾组织MAO活性升高、CAT活性下降，差别有统计学意义(P＜0.01)。与模型对照组对比，当归多糖各剂量组使肾组织MAO活性明显降低、CAT活性明显升高，以中、高剂量组最为明显，差别有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01);与脑复康组对比，差别无统计学意义(P ＞0.05)。见表4。

表4 各组小鼠肾组织MAO活性和CAT活性对比 ±s

表4 各组小鼠肾组织MAO活性和CAT活性对比 ±s

注:与空白对照组对比，＊＊P ＜0.01;与模型对照组对比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组 别 动物数 剂量/(μg·g－1) MAO/(U·mgprot－1) CAT/(U·gprot－1)10 10.93 ±1.49 340.99 ±70.73模型对照组 10 15.54±1.98＊＊ 163.49±52.01＊＊脑复康组 10 200 10.07 ±1.45## 284.25 ±30.19##当归多糖低剂量组 10 100 12.13 ±2.18# 240.30 ±46.44＊＊#当归多糖中剂量组 10 200 10.41 ±1.54## 278.23 ±42.49＊＊##当归多糖高剂量组 10 400 9.68 ±2.62## 297.94 ±29.10*##空白对照组

3 讨论

细胞衰老是生物体衰老的基本单元，也是各种老年病的发病基础。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，衰老机制的研究日趋深入，特别是衰老过程中p16基因的表达受到广泛关注。p16基因是一种细胞周期负调控因子，在人类细胞衰老过程中持续高表达［6］。金建生等［7］报道:将 WI-38 细胞从第24代开始与不同浓度的人参皂苷Rg1共同培养后，p16、CyclinD1表达水平降低，CDK4表达水平增加，说明Rg1延缓衰老的机制可能是改变细胞周期调控因子的表达而实现的。Duan等［8］以p16基因正反义载体分别转染年轻的人成纤维细胞，发现p16基因mRNA高表达导致细胞早衰，而其反义载体转染通过抑制p16基因mRNA表达可以延缓细胞衰老。韩旭等［9］研究也证实:参黄冲剂可有效改善衰老患者的临床症状，提高日常生活能力，提高血清NO含量和SOD活性，减少p16基因mRNA的表达，提示参黄冲剂抗衰老的机制是通过抑制衰老细胞增殖而实现的。本研究结果也显示:模型对照组小鼠脑组织p16蛋白的表达量增加(P＜0.01);给予当归多糖干预后，小鼠脑p16蛋白的表达降低，差别有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。提示当归多糖具有抑制衰老细胞增殖的作用。

有研究证实:体内代谢或外源性因素产生的自由基可诱导细胞凋亡［10］。自由基是指在最外层轨道中含有未配对电子的原子、原子团或特殊状态的分子。机体在正常情况下通过酶类和非酶类防御系统清除自身产生的自由基。但是，随着年龄的增长，机体抗氧化酶的活性逐渐下降，清除自由基的能力不断下降，导致机体氧自由基发生蓄积中毒;同时，这些氧自由基与核酸、蛋白质、氨基酸、脂质等反应，促进了机体的衰老［11］。其中MAO和CAT是研究衰老的重要指标之一。许多研究证明，MAO活性随年龄增加［12］，CAT 活性随年龄降低［13］。本研究结果也证实:模型对照组小鼠MAO活性升高，CAT活性降低(P＜0.01);给予当归多糖干预后，小鼠脑组织和肾组织MAO活性明显降低、肝组织和肾组织CAT活性明显增强，差别有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。提示当归多糖具有抗氧化作用。

综上所述:当归多糖具有延缓衰老的作用，其机制可能与提高机体抗氧化能力和下调衰老相关基因p16的过度表达有关。

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