HPLC-ELSD法测定老年咳喘片中黄芪甲苷的含量

郭 强

(河南省食品药品检验所，河南郑州450003)

老年咳喘片是《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第九册中的品种［1］。本品处方中含有黄芪、白术、防风、甘草、黄精、淫羊藿、补骨脂等中药材，其中黄芪为君药，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效。原标准未建立含量测定检测方法，为进一步提高和控制产品质量、保证疗效，本研究建立了测定黄芪中黄芪甲苷含量的高效液相色谱检测方法。本研究参照《中国药典》2010版一部黄芪药材项下含测方法［2］，结合有关参考文献［3－10］，采用高效液相色谱法－蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD法)测定了老年咳喘片中有效成分黄芪中黄芪甲苷的含量。该方法简便，快速，灵敏，重复性好，可用于该产品质量控制。

1 药品、试剂与仪器

老年咳喘片样品由河南羚锐制药股份有限公司提供，批号110104，110105，110106。黄芪甲苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，为含量测定用对照品，批号110781－2008613;乙腈，为色谱醇，供流动相配制用，Merck公司产品;水为超纯水;甲醇、正丁醇、氨水均为分析纯。Waters 2695高效液相色谱仪，配四元泵、自动进样器、Alltech公司ELSD2000蒸发光散射检测器;KQ－300型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(实验中用Agilent C18，4.6 mm × 250 mm，5 μm)，乙腈 － 水(32∶68)为流动相，体积流量 1.0 mL/min，柱温40℃。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4 000。

在此条件下对黄芪甲苷对照品溶液、老年咳喘片供试品溶液进行测定，HPLC色谱结果均较为理想，同法制备的老年咳喘片阴性样品(即不含黄芪药材的老年咳喘片)测定结果则为阴性，即未见与黄芪甲苷对照品保留时间相一致的峰，说明其他药材对样品测定无干扰。色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

对照品溶液:精密称取黄芪甲苷对照品10.59 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀;精密量取2 mL，置5 mL量瓶中，加入甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1毫升中含黄芪甲苷0.423 6 mg)。

图1 老年咳喘片HPLC色谱图

供试品溶液:取本品80片，除去包衣，精密称定，研细;取细粉8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中;精密加入甲醇100 mL，密塞，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min;滤过;精密量取续滤液50 mL，回收甲醇并浓缩至干;残渣加水30 mL微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次40 mL;合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次50 mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干;用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

分别精密吸取0.423 6 g/L黄芪甲苷对照品溶液 2，4，8，12，16，20 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值与进样量取对数后进行回归处理，黄芪甲苷在 0.847 2 ～8.472 0 μg 范围内，呈现良好的线性关系。回归方程为:Y=1.445 0X+5.575 0，r=0.999 4。

2.3.2 精密度试验

取同一黄芪甲苷对照品溶液，按上述色谱条件，连续测定6次(进样量10 μL)，测得峰面积积分值分别为 10 979 711，10 860 851，10 950 254，10 906 841，10 993 894，10 932 655。结果平均峰面积积分值为10 937 368，RSD=0.4%(n=6)。结果表明:该方法精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，按上述色谱条件分别在第0，1，3，6，9 h 各进样 1 次，每次进样 10 μL，测得峰面积积分值分别为3 914 875，3 885 792，3 965 229，3 934 280，4 051 114，结果平均峰面积积分值为32 36 518，RSD=0.50%(n=5)。结果表明:供试品溶液在9 h内稳定。

2.3.4 重现性试验

取同一批号的样品(批号为110104)6份，按上述测定方法试验，结果测得每片样品中含黄芪甲苷分别为0.091，0.093，0.095，0.089，0.090，0.088 mg/片，结果平均含量为 0.091 mg/片，RSD=2.86%(n=6)。结果表明:该法重现性较好。

2.3.5 回收率试验

精密称取已知含量的本品(批号110104，黄芪甲苷含量0.092 mg/片)5份，每份约4 g，精密称定，精密加入1.059 g/L黄芪甲苷对照品溶液1 mL，按供试品溶液的制备项下方法制备加样供试品溶液。按上述色谱条件测定，结果见表1。计算回收率，平均回收率为 98.49%，RSD=3.36%(n=5)。

表1 黄芪甲苷回收率测定结果

2.4 样品含量测定

按含量测定方法测定3批样品中黄芪甲苷的含量，结果见表2。

表2 3批样品黄芪甲苷含量测定结果

3 讨论

本文建立了高效液相色谱－蒸发光散射检测法测定老年咳喘片中黄芪甲苷含量的方法。该方法简便准确，快速灵敏，重现性好，可用于该产品定量控制。

3.1 含量测定方法的建立依据

黄芪为本方中的君药，黄芪中黄芪甲苷为其主要特征性有效成分，故选择黄芪甲苷作为控制本品质量的指标成分。关于黄芪甲苷的含量测定方法已有薄层扫描法、HPLC-UV法、HPLC-ELSD法。这几种方法中，薄层扫描法灵敏度、重现性都较差，前处理步骤多，干扰因素排除较困难;用HPLC-UV法黄芪甲苷仅在201 nm有较弱的末端吸收，操作条件十分严格，噪音对结果影响较大;而HPLC-ELSD法简便快速灵敏，克服了前两法的缺陷，灵敏度高，可作为检测黄芪甲苷含量的较为理想的测定方法。

3.2 提取条件的选择

取供试品8 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇的量比较了50，100，125 mL，超声处理时间比较了20，30，40 min，用水饱和的正丁醇振摇提取3次、6次，结果表明:在加入100 mL甲醇、超声处理30 min、用水饱和的正丁醇振摇提取3次的情况下，能够将黄芪甲苷提取完全。若增加甲醇的加入量、增加超声处理的时间、增加水饱和的正丁醇振摇提取的次数，黄芪甲苷的含量不再增加;若减少甲醇的加入量、减少超声处理的时间、减少提取的次数，均不能将黄芪甲苷充分提取。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂:第九册［M］.北京，1994:70.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:283.

［3］黄劲通.用HPLC法测定芪芳气颗粒(无糖型)中黄芪甲苷的含量［J］.求医问药:下半月，2011，9(10):78.

［4］梁东辉，朱黎霞，张英丰，等.高效液相色谱法测定黄芪提取物毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷的含量［J］.现代医药卫生，2012，24(8):1126.

［5］高建，夏泉，黄赵刚，等.HPLC-ELSD同时测定当归补血总苷中黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ［J］.中成药，2012，34(2):268.

［6］夏英，林新文，王刚.HPLC-ELSD法测定黄芪、蜜黄芪中黄芪甲苷的含量［J］.中医药导报，2007，4(9):77.

［7］王爽，张钰泉，张幸，等.HPLC-ELSD法测定黄芪汤颗粒剂中黄芪甲苷的含量［J］.长春中医药大学学报，2011，27(6):1048.

［8］霍红，李玉路，蔡航，等.高效液相色谱法测定黄芪桂枝五物颗粒中黄芪甲苷的含量［J］.武警医学，2011，22(12):1073.

［9］周萍，王成军，邓励.黄芪药渣中黄芪甲苷含量的测定［J］.安徽农业科学，2011，5(13):7773.

［10］王欣，郭宏伟，庞燕军，等.HPLC－ELSD法测定阿胶黄芪口服液中黄芪甲苷的含量［J］.现代中西医结合杂志，2011，20(13):1641.