低水平乙型肝炎病毒表面抗原S区序列分析

计玉仙，张志明，李建平，姜小建，肖改娥，马 莹，舒 放，姜立茹，王 鑫

（西安市中心医院 检验科，陕西 西安710003）

乙型病毒性肝炎是一种严重影响人类健康的危害性疾病，目前全球至少约有3亿乙型肝炎病毒携带者，感染乙型肝炎病毒可引起不同程度的急、慢性肝脏疾病［1］，近年来由于乙型病毒性肝炎疫苗、高效价免疫球蛋白以及抗病毒药物的广泛应用，造成部分乙型肝炎病毒表面抗原变异呈低水平表达［2］，临床上乙型肝炎病毒表面抗原含量大于0.15μg/L而小于5μg/L定义为低水平乙型肝炎病毒表面抗原，其成因较多［3］，本文就37例低水平乙型肝炎病毒S区特征进行初步研究和探索，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源

选取西安市中心医院2010年5月－2012年8月间门诊及住院37例低水平乙型肝炎病毒表面抗原患者，年龄23－64岁，平均年龄41±19岁，其中男18例，女19例，多次检测者只取首次资料，待测标本放置－20℃保存。

1.2 引物设计 根据美国GeneBank公布的HBV全基因序列，在S区设计两条引物，内引物Primer Pair1正 向 5’－TGTTTGCTGTACAAA－3’，反 向5’－TGGGAGTGGGCC－3’，外引物Primer Pair2正向 5’－TCACTACCAGCACG－3’， 反 向 5’－TCAGTTTACTAGT－3’引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.3 主要试剂与仪器 PCR Premix、Loading Buffer、Lysis Buffer（宝生物工程大连有限公司）、琼脂糖（BBI公司）、DL2000DNA Marker（MBI公司）、UNIQ－10核酸纯化柱（上海生工生物工程技术服务有限公司）、化学发光试剂盒（郑州安图绿科生物工程有限公司），HBsAg中和确认试剂盒（珠海丽珠试剂股份公司）、HBsAg标准物质2μg/L购自康彻思坦生物公司。郑州安图绿科生物工程有限公司LUMO－Autobio化学发光仪、美国应用生物公司ABI7300基因扩增检测仪、北京六一DYY－2C电泳仪、美国应用生物公司ABI3730测序仪。

1.4 方法

1.4.1 低水平HBsAg筛查及确认 采用酶联免疫ELISA法和化学发光法检测HBsAg并用HB－sAg中和试验进行确认［4］。

1.4.2 HBV－DNA模板的提取 取100μL血清加入等量DNA浓缩液震荡5s，12 000r/min离心10 min，去上清，沉淀中加入20μl DNA提取液，剧烈震荡5－10s，瞬间离心数秒，100℃金属浴处理10 min后12 000r/min离心5min。上清液2μl作为1st PCR的模板。

1.4.3 PCR 反应条件 （1）1st PCR反应 在PCR反应管（0.5ml）中加入2×PCR Premix 12.5μl，再向此反应管中加入2μl已处理好的标本和10.5μl的Primer Pair 1，高速离心数秒。按以下条件进行1st PCR反应94℃ 预变性1min，92℃变性30sec，55℃退火30s，72℃延伸5min共30个Cycles（2）2nd PCR反应 在PCR反应管0.5ml中加入2×PCR Premix 12.5μl，再向此反应管中加入2μl的1st PCR扩增液和10.5μl的Primer Pair 2，高速离心数秒，按以下条件进行2nd PCR反应92℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min共35个Cycles。

2 结果

2.1 电泳结果判定 向2nd PCR扩增液中加入5 μL的6×Loading Buffer，混匀后取10－15μL进行2%的琼脂糖凝胶电泳。PCR扩增液在230bp附近有DNA亮带，则此标本也可以判定为阳性（相当于HBsAg阳性）；如果2nd PCR扩增液在230bp附近没有DNA亮带，则此标本可判定为阴性。Control实验时，2nd PCR扩增液在350bp附近有DNA亮带（图1）。

图1 PCR扩增产物电泳结果

2.2 HBV血清学分型判定

HBV的血清学分型是由HBsAg第122个和第166个氨基酸是赖氨酸（或精氨酸来决定的。而实际上是由下述框中的DNA碱基（A或G）来决定的，决定d/y的碱基：（A－－d，G－－y）；决定r/w 的碱基：（A－－w，G－－r）。用2nd PCR扩增产物进行 DNA序列测定，测序结果（图2）按照以下标准（图3）判断其乙肝病毒的亚型（Adw、Adr、Ayr及Ayw）。

37例低水平乙型肝炎病毒表面抗原标本中，成功扩增并测序32份，其余5份扩增产物因不满足测序要求（没出现目的条带或条带质量不高）无法进行S区序列分析，32份成功测序标本经经美国国立医学图书馆中Genotyping在线分析，B型20例（62.5%，20/32），C 型12例（37.5%，12/32），与 Gene－Bank中收录的AF100309、AB014381参考序列同源性最高；血清学分型18例为adr，10例为adw，3例为ayw，1例为ayr，并发现21例S区核酸序列发生 点 突 变，突 变 率 为 （65.6%，21/32）分 别 为A514C、T562A 、G587A、A589C各1例，G508A、G509A、A529G、T531C、T581A 各 2 例，3 例G511A、4例G508C。

3 讨论

图2 低水平乙型肝炎病毒表面抗原S区测序结果

图3 乙肝病毒血清学分型（Adw、Adr、Ayr及Ayw）判定标准

乙型肝炎病毒简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，主要分为A－H 8个基因型，由于基因型分布与地域和人群密切相关，国内学者对各地HBV基因型分布已进行了广泛研究，2011年王林川［5］等对西安地区348例乙肝患者分型表明HBV B基因型87例（24.2%）；C型233例（64.7%）；B＋C混合型2例（0.56%），未检出 A、D、E、F、G、H 型，与本文32份该地区低水平乙型肝炎病毒B型20例（62.5%，20/32），C型12例（37.5%，12/32）研究群体有明显差异（P＜0.01）。

HBsAg是乙肝病毒包膜的主要蛋白，HBsAg有一个特异的共同抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d/y”和“w/r”，根据其抗原性的不同主要分为4个血清型（HBsAg的亚型）即Adw、Adr、Ayr、Ayw，最常见的血清型为Adw、Adr和ayw，我国绝大数地区以Adr为主，Adw次之，新疆、西藏、内蒙古［6－8］等自治区的本地民族几乎全为Ayw。32例低水平乙型肝炎经血清学分型18例为Adr，10例为Adw，3例为Ayw，1例为 Ayr，血清型分布与一般乙型肝炎病毒血清型分布无差异。

HBV DNA聚合酶因缺乏矫正功能，乙肝病毒是突变频率很高的DNA病毒，尤其在目前抗病毒药物广泛应用的情况下［9］，本研究中共有21例低水平乙型肝炎病毒表面抗原S区发生突变，突变率为65.6%，其中15例突变不会引起编码抗原决定簇氨基酸突变，为无义突变，突变点分别是A514C、T562A各1例，G508A、G509A、A529G各2例，3例G511A、4例 G508C，而其他6例如 T531C、T581A各2例，G587A、A591C各1例核苷酸点突变均可引起抗原决定族编码的氨基酸的改变如I126T、S143T、G145R、N146T，从而导致表面抗原结构改变。

乙型肝炎病毒表面抗原S区核苷酸编码的变异可能导致临床上常规检测方法无法准确检测而导致漏检、误诊，也可能因为S区核苷酸编码的变异导致临床常规治疗无效，总之，对低水平乙型肝炎病毒表面抗原患者S区序列的研究将为低水平乙型肝炎发病机制、流行病学以及个体化治疗奠定基础。

［1］Costa CA，Kimura LO.Molecular epidemiology of hepatitis B virus among the indigenous population of the Curuca and Itaquai Rivers，Javari Valley，State of Amazonas，Brazil［J］.Rev Soc Bras Med Trop，2012，4：457.

［2］Bamaga MS，Sobahy TM，Attar AA.Quantitative DNA analysis of very low－level hepatitis B viremic patients reporting to the gastroenterology clinic［J］.Saudi Med J，2011，32（2）：135.

［3］成 军，孙长贵，陈 瑜.慢性HBV感染者低浓度HBsAg持续存在的临床特点及分子流行病学研究进展［J］.现代检验医学杂志，2010，25（2）：1.

［4］计玉仙，张志明，姜小建，等.化学发光法检测低水平 HBsAg性能及临床应用评价［J］.现代检验医学杂志，2012，27（6）：101.

［5］王林川，陈 葳，张阿丽.应用nested－PCR对西安市乙肝病毒基因型的研究［J］.细胞与分子免疫学杂志，2011，27（7）：803.

［6］周 艳，刘发娣，刘金娣，等.儿童感染的乙型肝炎病毒S基因的分子特征［J］.南昌大学学报（医学版），2011，51（6）：17.

［7］Zhu C T，D Dng CL.Characteristics of general distribution of hepatitis B virus genotypes in china［J］.Hepatobiliary Pancrea Dis Int，2009，8（4）：397.

［8］王学燕，陈钦艳，杨进业，等.广西HBsAg无症状携带者HBV前S基因缺失突变的分子流行病学研究［J］.应用预防医学，2012，18（2）：65.

［9］张志明，计玉仙.低水平乙型肝炎病毒表面抗原研究现状［J］.国际检验医学杂志，2012，33（3）：871.