应用生物信息学方法筛选猪肺炎支原体保护性抗原

王豪举，王 博，丁红雷，2

（1．西南大学动物科技学院，重庆 北陪400715；2．重庆生产力促进中心，重庆 渝北401147）

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Mhp）引起的一种慢性、接触性传染病，是猪场最常见的疫病之一。该病通常不引起猪只的死亡，但会使其出现发热、咳嗽、呼吸困难等症状，造成食欲减退、生长阻滞，饲料转化率降低。该病通常与猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、伪狂犬病等病毒性疾病和副猪嗜血杆菌病、巴氏杆菌病、链球菌病等细菌性疾病相互影响，形成猪呼吸系统疾病综合征（Porcine respiration Disease Complex，PRDC），造成养猪业的重大损失。

面对该病造成的严重危害，疫苗的使用成为防控该病的首选，而疫苗研制的核心是寻找和鉴定保护性抗原。反向疫苗学［1］研究策略的建立，使得人们能够从病原微生物的全基因组序列出发，全面系统地预测、分析和验证这些病原微生物的全部可能的候选疫苗蛋白抗原。目前已经有4个Mhp菌株的全基因组测序工作完成，包括3个强毒株和1个无毒株，这为我们应用反向疫苗学方法分析和预测Mph疫苗候选抗原创造了条件。本文着重论述了采用生物信息学方法，以Mhp强毒株232菌株作为出发菌株，结合其他菌株的基因组信息，从全基因组水平筛选候选抗原，为后续的研究提供候选抗原靶点。

1 材料与方法

1．1 材料 Mhp232、Mhp168、Mhp7 448、Mhp J菌株全基因组序列及其他相关基因序列从美国国立生物技术信息中心网站（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）获得。

在线预测软件SignalP 3．0［2］、DAS［3］、PSOR－Tb［4］、CELLO［5］、SOSUI－GramN［6］等通过互联网获得。

1．2 在线预测 外膜蛋白和分泌蛋白是首选的疫苗候选蛋白抗原。我们采用逐级缩小范围和平行预测相结合的方法预测该类蛋白。

以能引起猪支原体肺炎典型临床症状的Mhp强毒株232株作为基础，根据其全基因组对应的相应氨基酸序列，用SignalP 3．0软件预测并筛选含有信号肽的蛋白；同时，用DAS软件预测有跨膜区蛋白。将同时有信号肽和跨膜区的蛋白作为下一步预测的候选蛋白。

用PSORTb 3．0．2、CELLO version 2．5、SOSUI－GramN进一步预测上述蛋白的亚细胞定位，这3个软件均能预测革兰阴性细菌和支原体的胞质蛋白、内膜蛋白、周质蛋白、外膜蛋白和分泌蛋白。

根据上述结果，选取同时含有信号肽和跨膜区并被3个预测亚细胞定位的软件有两个预测为外膜蛋白或分泌蛋白的蛋白作为下一步预测的候选蛋白。

将上一步预测的蛋白与 Mhp 168、7 448、J菌株的基因组对应的蛋白的氨基酸序列比对，选取同时存在于此4个已测序菌株中且保守型较高的蛋白作为下一步预测的候选蛋白。

将上一步预测的蛋白与猪的基因组中所对应的蛋白的氨基酸序列进行BLAST比对，去除和猪的基因组对应蛋白同源性超过10%的蛋白。剩余的蛋白作为本次预测的疫苗候选蛋白抗原。

2 结果

2．1 Mhp 232菌株可能的膜蛋白或分泌蛋白预测结果 Mhp 232菌株基因组全长892 758bp，共编码691个蛋白基因。为了增加信号肽分析的可靠性，对每一个候选蛋白同时采用SignalP 3．0的神经网络模型（Neural Network Model，NN）和隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）进行分析，为了避免漏掉可能的候选蛋白，我们把两个模型中其中有一个预测出可能存在信号肽的蛋白即将其判定为有信号肽。对Mhp232菌株691个候选蛋白的分析表明，有412个蛋白含有信号肽序列。通过用DAS软件分析预测，共有407个蛋白存在跨膜区。我们将同时存在信号肽和跨膜区的301个蛋白判定为下一步预测的候选蛋白。

2．2 Mhp 232菌株可能的外膜蛋白和／或分泌蛋白预测结果 在预测的Mhp232菌株301个可能的膜蛋白和分泌蛋白中，用PSORTb 3．0．2软件预测，36个为外膜蛋白、1个为分泌蛋白，32个为可位于多个亚细胞位置的蛋白。用CELLO version 2．5软件预测，85个为外膜蛋白，4个为分泌蛋白，38个为可位于多个亚细胞位置的蛋白；用SOSUIGramN软件预测，48个为外膜蛋白，21个为分泌蛋白。将其中两个软件共同预测为外膜蛋白和／或分泌蛋白的67个候选蛋白判定为232菌株中初步预测的候选蛋白抗原。

2．3 Mhp疫苗候选蛋白抗原的生物信息学预测结果 将232菌株中的候选蛋白抗原进一步与168、7 448、J菌株中相对应的氨基酸与核苷酸序列比对，mhp444在J菌株为假基因，mhp017和mhp535基因在7 448菌株中存在同源序列，mhp532和mhp534基因在168菌株中存在同源序列，其余蛋白在其他三个已进行全基因组测序菌株中均存在同源序列。基于 Mhp017、Mhp444、Mhp532、Mhp534和Mhp535蛋白在Mhp菌株中保守性较差，将这5个蛋白在候选蛋白中去掉。其余基因的核苷酸序列同源性在86%～100%，其中只有3个低于95%，氨基酸序列同源性在88%～100%，也只有3个低于95%。

将这些蛋白与猪基因组中的所有基因对应的蛋白进行BLAST序列比对分析，这些蛋白均与Gen－Bank中已存在的猪的蛋白无同源性。将最终预测的62个蛋白均作为Mhp疫苗候选抗原（见表1）。

表1 猪肺炎支原体候选疫苗蛋白抗原

3 讨论

目前对猪支原体肺炎尚无很好的治疗办法，临床上常用抗生素来控制病情的进一步发展。但随着耐药菌株越来越多，该病面临无药可用的境地。提高管理水平同时联合使用疫苗能够在一定程度上控制该病的蔓延，且已有多个灭活和减毒猪支原体肺炎疫苗在临床上使用。但目前市售疫苗仍然存在两个重要缺陷：一是免疫保护效果较差。接种该疫苗后，只有不超过50%的免疫猪能够得到有效保护，这一保护比例和人们的期望值相比还有比较大的差距。二是接种疫苗后，猪只仍然能够带菌，并在猪群内和猪群之间传播。

从整体防控来看，使用疫苗预防是降低该病发生，减少经济损失最有前途和最经济的途径。因此，制备有效的既能预防猪只感染又能显著降低猪群中病原蔓延的疫苗就成为防控Mhp的核心。重新设计并制备具有高免疫保护力的疫苗对于预防该病的发生和病原的传播有重要意义。采用反向疫苗学策略，从全基因水平来筛选具有高保护性候选抗原是现代疫苗学发展的方向。一、能够大量获取有重要免疫学效应又在病原体内表达较少，不能有效刺激机体产生免疫反应的抗原。二、能够评价传统疫苗中缺失的与致病密切相关的分泌蛋白，避免了疫苗设计中关键蛋白的缺失。三、某些在病原体的致病过程中发挥重要作用的蛋白，在病原体非天然生存状态下，如体外培养中，其表达可能关闭。这是灭活疫苗制备中的重大缺陷。利用反向疫苗学则可以高效表达和筛选这些蛋白。

合适的保护性抗原首先应该是位于菌体表面或者是分泌性的。这样的抗原最易与机体的免疫系统接近，激发机体产生免疫反应。支原体的细胞膜由内膜、外膜脂质双层组成，内外膜之间构成周质空间。一些蛋白位于膜上，发挥传递细胞信号、能量物质代谢等功能。外膜蛋白和分泌蛋白是病原菌刺激宿主细胞产生免疫应答最主要的蛋白。这也是为什么要选择外膜蛋白和分泌蛋白作为候选蛋白抗原的原因。其次，保护性抗原应该是保守的。病原体的复制、代谢以及致病是长时间进化的结果，导致宿主致病也是其获得物质代谢的原料、维持生命活动必不可少的过程。因此，这些维持生命活动的关键蛋白应该是保守的。所以，选择保守性强的蛋白也是在筛选疫苗候选蛋白抗原的一个重要原则。从本次在全基因组水平预测的结果来看，Mhp的所有62个候选蛋白抗原存在于所有已测序的Mhp菌株。因此，这些蛋白是保守性很高的候选抗原。

Mhp183（P97）、Mhp378、Mhp677（P65）是目前最常用的 Mhp疫苗候选抗原［7－8］，它的部分功能也已经被阐明。但其作为候选抗原制备的疫苗与传统Mhp疫苗相比免疫效果并无明显改善，可能这些蛋白不是Mhp致病的最主要的致病因素，或者只是在Mhp导致的宿主细胞病理损伤中的一个小小环节，这些环节缺失在一定程度上是可以被代偿的，或者还需要其他蛋白协同才能发挥作用。在Mhp与宿主细胞相互作用的过程中，其他蛋白也发挥着重要作用，如 Mhp182、Mhp280、Mhp494。在本研究所预测筛选的62个候选蛋白抗原中，有44个是未知功能的推定蛋白，占71%，他们非常保守，又处于和宿主细胞进行物质和信号交换的外膜或胞外，他们在Mhp与外界的物质、能量和信号交换中可能发挥不可替代的或极其重要的作用，是疫苗制备中重要的蛋白抗原。

另外，基于这些推定蛋白的关键位置和保守性，也为研究Mhp的致病过程、致病机理和免疫反应机制提供了良好的目标分子。他们的功能需要大量的基础研究去阐明，研究他们在Mhp的致病中扮演什么样的角色。因此，本研究也为基础研究提供了大量的候选蛋白。

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