EDSV－HB株六邻体蛋白免疫原性试验

杜冬华，周 静，王爱华

（河北北方学院动物科技学院动物医学系，河北 张家口075131）

鸡减蛋综合征（EDS－76）是由鸡减蛋综合征病毒引起的，临床症状主要表现为产蛋鸡产薄壳蛋或无壳蛋，产蛋率严重下降，是世界范围内危害养鸡业的重要疾病之一。

现已证实，EDSV基因组由线性双链DNA组成，DNA的分子量为33kb，主要编码五邻体、pⅧ、六邻体、pⅥ、纤维蛋白、DNA结合蛋白、DNA多聚合酶、100k、末端蛋白、lvaⅡ等结构蛋白。其中，六邻体蛋白是EDSV的主要结构蛋白，多肽长910个氨基酸，约110kD，它与五邻体蛋白和纤维蛋白一起构成腺病毒的衣壳，并决定病毒粒子的大小，其中含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的抗原决定簇，对研制基因工程疫苗具有重要的意义［1－4］。

但目前对EDSV 六邻体基因的研究局限于对其基因序列的分析，然后推导出氨基酸序列，对六邻体蛋白的表达及功能的研究较少。因此，现在对减蛋综合征病毒详细的分子生物学背景仍不清楚，阻碍了后续研究进展。本试验旨在对鸡减蛋综合征病毒河北分离株进行研究，利用大肠杆菌原核表达系统，表达出六邻体蛋白，探索其用于免疫预防的可行性，对研制基因工程疫苗有重要意义。

1 材料与方法

1．1 材料 鸡抗 EDSV 国际标准株（AV－127）血清，购自中国兽医药品监察所；兔抗EDSV－HB株血清由河北北方学院预防兽医实验室制备。

重组质粒：包含六邻体（Hexon）基因序列的重组质粒pBS－H由本课题组构建。

1．2 Hexon基因原核表达载体构建 将含Hexon基因重组质粒pBS－H 和原核表达载体pET－32a－c（＋）用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，纯化后将二者连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，阳性重组质粒命名为pET－H。

1．3 目的基因的诱导表达 将重组质粒pET－H转化BL21（DE3），接入含 AMP（200μg／mL）的LB培养基。37℃振荡培养至OD600＝0．6。从中取1 mL作为对照。剩余样品加入IPTG至终浓度1 mmol／L，继续培养3h。摇瓶冰浴5min，5 000r／min（4℃）离心5min收集菌体，弃上清，加入100 μL 1×SDS上样缓冲液，100℃煮沸10min 12 000 r／min（4℃）离心5min，取上清液10μL，参考文献［5］方法，用7．5%的SDS－PAGE、Western－blotting检测表达产物。

1．4 重组蛋白的大量表达 挑取重组菌单菌落接种于10mL氨苄青霉素／LB培养基中，37℃振荡培养过夜，接入2 000mL Amp／LB液体培养基，按上述方法诱导表达。参考文献［9］方法，测定蛋白溶解性，纯化表达蛋白。

1．5 重组蛋白动物免疫试验 取6只6周龄鸡，初次免疫将重组蛋白与福氏完全佐剂按1∶1的比例混合乳化，胸肌多点注射，100μg／只。2免和3免，将重组蛋白与不完全福氏佐剂按1∶1比例混合、乳化，加强免疫两次，150μg／只，每次免疫间隔10d。3免后15d采集血样并分离血清，用间接ELISA方法检测免疫鸡抗体水平。

2 试验结果

2．1 重组质粒pET－H双酶切鉴定 重组质粒pET－H用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定，结果出现两个条带，其大小分别为2．7kb及5．9kb。表明Hexon基因已正确连接到pET－32a－c（＋）表达载体（见图1）。

2．2 目的蛋白的表达 重组表达载体转化BL21表达菌株经诱导后，用SDS－PAGE方法分析，出现一条约110kDa的条带，与预期结果相符，而未经诱导菌株及空载体pET－32a的对照菌则未出现这一条带，如图2所示。

2．3 Western－blotting鉴定重组蛋白 将目的蛋白和空载体表达产物裂解后进行SDS－PAGE，再转移到醋酸纤维膜上，兔抗EDSV－HB株血清作为一抗与之特异性结合，再经HRP标记的羊抗兔IgG显色，出现一条特异性抗原抗体结合带，而空载体没有，从而证明表达的目的蛋白是Hexon蛋白，结果如图3。

2．4 免疫鸡抗重组蛋白血清效价的检测 将纯化后的六邻体蛋白以最佳包被浓度（1∶200，15μg／mL）包被96孔酶标反应板，按文献［9］方法测定免疫鸡的抗体效价，设阴性对照组，结果见表3。

阴性血清 OD490平均值为0．082，标准差为0．014，阴阳性临界值为＝0．082＋ 3×0．014＝0．124，即阳性受检血清抗体效价为OD490值高于0．124的最高血清稀释倍数。

由表3可以看出，在免疫鸡中，产生抗六邻体蛋白的抗体效价最高达1∶12 800，且多数免疫鸡抗体效价均在1∶6 400以上。表明体外表达的重组六邻体蛋白能够保留天然蛋白所具有的免疫原性。

表3 六邻体蛋白免疫鸡后ELISA抗体效价

3 讨论

3．1 本试验用pET－32a－c（＋）原核表达载体对鸡减蛋综合征病毒河北分离株六邻体蛋白进行了优化表达。表达的重组蛋白分子量约110kDa，经SDSPAGE电泳分析，分子量与预期一致。之后，用Western－blotting方法检测重组蛋白，用兔抗EDSV河北分离株阳性血清作为一抗与之进行特异性结合，再经HRP标记的羊抗兔IgG二抗显色，出现一条特异性的抗原抗体结合带，而空载体则没有，从而证明表达的目的蛋白是六邻体蛋白，同时也可表明该重组蛋白具有免疫原性。

3．2 本试验旨在探索用重组的六邻体蛋白预防鸡减蛋综合征的可行性，纯化的重组六邻体蛋白免疫6周龄试验鸡后，3免后用间接ELISA方法检测血清抗体水平。结果表明，本试验得到的重组六邻体蛋白能够刺激机体产生高水平抗体，充分证明重组的六邻体蛋白具有很好的免疫原性，为研制减蛋综合征基因工程疫苗打下良好的基础，但其生产成本、免疫剂量及免疫佐剂等方面的问题都有待进一步的解决。

［1］ 肖妙，工君伟．减蛋综合症病毒五邻体重组蛋自的原核表达及抗原性鉴定［J］．东北农业大学学报，2009，40（2）：83－87．

［2］ 吴国平．鸡减蛋综合征病毒分子生物学研究近况［J］．中国预防兽医学报，2002，22（2）：156－158．

［3］ 张春杰，张敏，吴庭才，等．EDSV六邻体蛋白基因克隆与原核表达载体构建［J］．河南科技大学学报，2005，4（26）：80－82．

［4］ 罗君毅，盖伟伟，雷磊，等．SARS－CoV S蛋白的原核表达及其黏膜免疫效应［J］．武汉大学学报，2006，6（52）：733－738．

［5］ J．萨姆布鲁克，D．W．拉塞尔著，黄培堂，等译．分子克隆实验指南［M］．第三版．北京：科学出版社，2002：96－98．