罗非鱼非肠道组织内粪肠球菌的分离和鉴定

左 跃，易 弋，夏 杰，杨 军，冯 丹，罗福广，伍时华

（1．广西工学院生物与化学工程系，广西 柳州545006；2．柳州市渔业技术推广站，广西 柳州545006；3．国家罗非鱼产业技术体系柳州综合试验站，广西 柳州545006）

近年来，罗非鱼链球菌病给罗非鱼产业带来了巨大的经济损失。该病在我国南方地区5～10月份的高温期容易流行，患病罗非鱼眼球突出，眼眶出血，肛门肿大，在水中打转游动，剖检病鱼，常见肝脏肿大，胃肠膨大等症状。且具有暴发速度快，波及范围广，死亡率高的特点［1－2］。罗非鱼链球菌病的主要病原为无乳链球菌［3］和海豚链球菌［4］，其致病机理尚不明确。本试验在患病罗非鱼体的肝、肾、血液组织中分离鉴定出具有β溶血性的无乳链球菌的同时，分离出一株具有γ溶血性的菌株77γ。经生理生化及分子鉴定，确定该菌株为粪肠球菌。由于粪肠球菌是鱼类肠道内的正常菌群，不会感染到非肠组织，我们认为致病性的无乳链球菌可能破坏了罗非鱼组织间的屏障，从而引起了粪肠球菌在罗非鱼各组织间的转移。

1 材料与方法

1．1 试验材料 发病罗非鱼样本采自广西柳州市渔业技术推广站罗非鱼养殖基地；BHI培养基、链球菌细菌生化编码鉴定试剂盒、革兰阳性球菌药敏试剂盒，购自杭州天和微生物试剂有限公司；血平板，购自广东环凯微生物科技有限公司；预混DNA聚合酶，购自北京康为世纪生物科技有限公司；pMD18－T Vector，购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。

1．2 分离纯化与培养 将患病罗非鱼解剖，用烧红的接种针插入到肝、肾以及血管内，在组织内轻微搅动5～10s后，于血平板划线分离，30℃恒温培养24 h。反复划线分离直至纯化。纯化后的菌株在BHI培养基中30℃培养。

1．3 形态学观察 取培养24h的菌体，经革兰染色后于显微镜下观察菌体形态。

1．4 生理生化鉴定及药敏试验 采用链球菌细菌生化编码鉴定试剂盒进行生理生化试验，通过对应的《链球菌生化编码鉴定手册》（GYZ－12St）进行鉴定。

按常规纸片法进行药敏试验，并按照说明书给出的标准判定菌株对药物的敏感度。

1．5 16SrDNA序列分析 将纯化后的细菌接种于BHI液体培养基中，30℃培养24h。以菌液作为PCR模板，采用引物27F：（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和引物1492R：（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）扩增细菌的16SrDNA［5］。反应体系（50μL）：2×EsTaqMaster Mix 25μL，模板2μL，引物（10μmol／L）各2μL，ddH2O 19μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃10min。PCR产物经1．0%琼脂糖凝胶电泳进行胶回收，回收产物经TA克隆后转化到JM109大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有50μg／mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃培养12h。所得阳性克隆，经质粒提取和PCR验证后送至上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。将序列提交至GenBank数据库进行BLAST分析，采用MEGA5软件将同源性相近的序列构建进化树。

1．6 无乳链球菌与粪肠球菌共培养 将无乳链球菌和粪肠球菌同时接种于BHI液体培养基，30℃培养24h后，将混合菌液稀释至不同浓度梯度，取100 μL于血平板上涂布，30℃培养24h。利用2种细菌溶血性不同分别进行计数。

2 结果与分析

2．1 菌株形态 从患病鱼体的肝、肾和血液组织中均分离得到2种细菌，其中一种具有β溶血性，后鉴定为致病性无乳链球菌。另一种具有γ溶血性（分别命名为77γG、77γS和77γX），菌落为黄色，表面大而光滑，培养24h后直径1～2mm，边缘齐整。菌体革兰染色呈阳性，为球形，直径约0．5μm，单个或者成对排列（图1）。

图1 分离菌株的显微形态

2．2 生理生化鉴定 将纯化后的菌落分别接种于链球菌细菌生化编码鉴定管，按说明书要求进行操作。结果显示，菌株77γG、77γS和77γX的生理生化鉴定结果一致，如（表1）所示。参照《链球菌生化编码鉴定手册》（GYZ－12St）初步鉴定77γG、77γS和77γX均为粪肠球菌。

表1 菌株生理生化特性

基于上述鉴定结果，补做分离菌株在10℃，45℃以及6．5%氯化钠条件下的生长试验。结果表明，分离菌株在上述条件下均可以生长。这一试验结果符合粪肠球菌的生长特性。

2．3 药敏试验 见表2。

表2 药敏试验

药敏试验结果显示，菌株77γG、77γS和77γX的药敏性完全一致，均对苯唑西林等5种抗生素具有抗性（表2），表现出多重耐药性。由于粪肠球菌细胞壁坚厚，对许多抗生素能表现出固有耐药，同时也容易被诱导产生新的耐药性［6］。近年来罗非鱼链球菌病大面积暴发，养殖户大量使用抗生素以降低养殖风险。长期生长在含抗生素的环境中也可能是本文所分离的粪肠球菌具有多重耐药性的原因之一。

2．4 16SrDNA序列分析 使用引物27F和1492R分别扩增菌株77γG、77γS和77γX的16SrDNA序列，均能得到1 500bp左右的特异性条带。测序结果显示，3株细菌的16SrDNA序列完全相同，由此可以确定3株细菌为同一种细菌，命名为77γ。BLAST显示，菌株77γ的16SrDNA基因与粪肠球菌的16S rDNA基因具有高度同源性，进化树分析表明，77γ与粪肠球菌具有最近的亲缘关系（图2）。

图2 菌株77γ和相关菌种的系统进化树

通过生理生化和分子鉴定，我们确定了从感染无乳链球菌的罗非鱼肝、肾和血液组织中分离出的这株具γ溶血性的革兰阳性球菌为粪肠球菌。

2．5 无乳链球菌与粪肠球菌共培养 按1．6的方法将无乳链球菌和粪肠球菌77γ进行共培养后计数，发现混合菌液中绝大多数是粪肠球菌，只有少部分是无乳链球菌，并测得培养基的pH值由初始的7．4下降到5．5。其原因可能为粪肠球菌在生长过程中产酸，降低了培养基的pH值，抑制了最适生长pH值为7．4～7．6的无乳链球菌的生长。

3 讨论

近年来，罗非鱼链球菌病大面积暴发，给养殖户带来了巨大经济损失。该病的主要病原是无乳链球菌和海豚链球菌，在患病的同时，常常伴随着其他致病菌的共同感染［7］。本试验在患病罗非鱼的非肠组织内分离出致病性无乳链球菌的同时分离出了1株粪肠球菌，首次报道了粪肠球菌和无乳链球菌共同感染罗非鱼的现象。

粪肠球菌是罗非鱼肠道内的正常菌群，可作为益生菌使用［8］，同时也有部分粪肠球菌是条件致病菌，能感染鸭［9］、羊［10］等动物致病。但粪肠球菌感染鱼类致病的报道极少，因此很难断定本文所分离的粪肠球菌77γ是否为罗非鱼的致病菌。但根据77γ无溶血性这一特征，我们倾向于认为77γ是罗非鱼肠道中的正常微生物。

根据2．5的结果，粪肠球菌在生长过程中所产生的酸能抑制无乳链球菌的生长，推测无乳链球菌很难在粪肠球菌大量繁殖后的组织中再进行感染。粪肠球菌作为鱼类肠道的正常菌群也很难在正常情况下突破组织间屏障感染到其他器官。而无乳链球菌作为一种特殊的致病菌，能够破坏血脑屏障，感染到鱼的大脑［11］。因此，我们推测粪肠球菌和无乳链球菌共同感染罗非鱼的原因可能是无乳链球菌首先感染了罗非鱼，并在各组织器官中繁殖，当达到一定浓度后，引起链球菌疾病暴发。链球菌病暴发后，鱼体各机能下降，再加上无乳链球菌的作用，破坏了组织间屏障（如肠黏膜屏障），使得肠道内的粪肠球菌转移到了其他非肠组织器官。

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