抗柔嫩艾美耳球虫ScFv－PE40重组毒素的活性测定

郝景锋，吴 斌，蔡华东，赵 权

（1．吉林农业科技学院动物医学学院，吉林 吉林 132101；2．吉林省磐石市园艺特产技术推广站，吉林 磐石 132300；3．吉林农业大学研究生院，吉林 长春 130118）

作为鸡球虫病主要的病原体之一，柔嫩艾美耳球虫（E．tenella）对雏鸡的危害非常严重，针对柔嫩艾美球虫病，目前主要依靠药物防治和疫苗免疫。由于药物防治存在耐药性和药物残留问题，效果不太理想；同时，活苗免疫不但具有潜在的致病力，而且生产成本较高，免疫程序复杂，特别是免疫后的监测和管理技术要求较高，不能得到广泛应用［1］。这就需要找到其他更为安全、简单、廉价、有效的防治措施。近些年来，多种球虫保护性抗原基因被克隆表达，在已经报道E．tenella基因中，ScFv基因编码的抗原位于子孢子折光体上，在球虫孢子生殖阶段过渡到裂殖生殖阶段发挥很重要的生物学功能，其基因表达产物具有一定的免疫保护作用，而且对其他球虫具有一定的交叉保护［2］。因此，利用分子生物学技术研制基因工程疫苗已成为当前防治球虫病较为理想的选择。

本实验室已经对E．tenella子孢子表面抗原ScFv基因进行了克隆和序列测定，将目的基因连接pET28a（＋）载体进行原核表达后，对海蓝小公雏感染柔嫩艾美耳球虫的保护效果进行观察评价，为进一步在临床上控制鸡球虫病提供科学的依据。

1 材料与方法

1．1 材料 重组免疫毒素（吉林农业大学寄生虫实验室馈赠）：本试验构建重组毒素时使用的是pET28a（＋）表达载体，因其表达的蛋白产物N末端包含His－Tag，所以能够采用金属Ni2＋亲和层析柱方法纯化该目的蛋白。试验动物：1日龄海蓝小公雏，购自长春市北方养鸡场。E．tenella虫株，由吉林农业大学寄生虫实验室保存。

1．2 方法

1．2．1 试验分组 设立阴性对照（非感染非免疫对照组）为第1组，阳性对照（感染非免疫对照组）为第2组，试验组即重组免疫毒素组为第3组。

1．2．2 试验设计 试验动物选取1日龄的球虫检测阴性海蓝公雏鸡，饲养至12日龄随机分成3组，每组20羽，自由饮水采食，首免于14日龄，100μg／羽，胸部肌肉注射，采用同样剂量于21日龄加强免疫，于28日龄先称重，每羽口服1×105个易感染的E．tenella孢子化卵囊，逐日观察记录精神状态以及死亡数量，36日龄宰杀，逐只称重、盲肠病变计分以及卵囊计数，计算ACI，应用SPSS 13．0软件进行数据分析。

1．2．3 抗球虫效果的判定

1．2．3．1 盲肠病变值与判定指标 36日龄试验鸡先称重，宰杀，按Johnson方法判定盲肠病变记分，标准如下：剖检未见任何病变记为0分；盲肠壁出现极少数出血点且内容物正常记作＋1；盲肠出血，肠壁肥厚，有出血点记作＋2；盲肠出现栓塞，大量出血，肠壁萎缩或者变形记作＋3；盲肠内出现栓芯或者凝血块，盲肠萎缩严重，肠壁增厚记作＋4。若两侧病变程度不相同时，按照病变较严重侧计算［3］。

病变值＝各组平均病变记分×10

1．2．3．2 OPG值测定 从感染后第5天开始，每天收集1～5组的粪便至攻虫后第9天。采用司陶尔虫卵记数法测定OPG值［4］。

表1 克盲肠内容物卵囊值换算标准

1．2．3．3 增重 本次增重指标的测定范围是20～36日龄，计算公式如下：平均增重＝扑杀时平均体重一攻虫前平均体重；平均增重率＝平均增重／攻虫前平均体重

相对增重率（%）＝平均增重率／阴性对照组平均增重率×100%

1．2．3．4 抗球虫指数（ACI） 根据如下公式计算：ACI＝（相对增重率＋存活率）－（病变值＋卵囊值）

ACI＞180时即为保护效果明显；ACI为160～179时即为保护效果较好；ACI为160～120时即为保护效果一般；ACI＜120时即为无保护效果［5］。

2 试验结果

2．1 临床症状观察结果 21日龄后第3组鸡未出现明显异常状况，各鸡只精神状态良好。攻虫后第5天，第2、3组试验鸡只陆续出现精神沉郁，食欲减退，第2组鸡粪便出血严重，第3组粪便少量出血。各试验组分别用饱和食盐水漂浮法进行卵囊计数，结果显示已有卵囊生成。第2，3组鸡于感染后第6～9天均检出卵囊，第2组卵囊数量较高。期间第1组鸡未出现任何异常，粪检时无卵囊出现。

2．2 鸡只增重变化 从表2可以看出，使用SPSS 13．0软件进行统计分析，攻虫前，各试验分组差异均不显著（P＞0．05），表明疫苗免疫对增重基本未产生影响。宰杀之前，第3组试验鸡体重增重明显高于阳性对照组，差异显著（P＜0．05），说明融合蛋白对E．tenella感染具有一定的抵抗作用。第3组与第1组体重差异显著（P＜0．05），说明试验组对E．tenella感染不能完全保护。

2．3 盲肠病变计分 盲肠病变计分统计情况如表3所示。由表3可看出各试验组与阴性对照组的差异均显著，第3组与第2组差异显著，第3组的盲肠病变记分最小，为1．8，抗球虫效果较好。

2．4 OPG值测定结果 33～36日龄各组鸡的粪便卵囊计数（OPG）值测定结果见表4，由表4可以看出，试验各组与阴性对照组比较差异均显著，并且与阳性对照组差异显著。其中第3组的OPG值最小为15 000，卵囊数量下降率最大，为40．78%。2．5 重组蛋白免疫对球虫感染的综合保护效果从表4可以看出，各组的ACI值，重组免疫毒素组较高，对鸡体具有较好的保护效果。

表2 重组蛋白免疫对球虫感染的增重效果的影响

表3 盲肠病变记分

表4 感染后5～9d各组雏鸡的OPG值

表5 重组蛋白免疫对球虫感染的保护效果

3 讨论

鸡球虫病是鸡常见且危害十分严重的寄生虫病，是由一种或多种球虫引起的急性流行性寄生虫病。雏鸡感染球虫后，主要症状可见大量肠上皮细胞受损、出血，严重者造成死亡，病愈鸡长期不能康复，生长及生产性能都受到严重影响。它造成的经济损失是惊人的，是严重威胁着封闭式工厂化养鸡发展的一种重要的疾病。近年来，多种球虫保护性抗原基因被克隆表达，利用基因工程技术生产基因工程疫苗用于预防鸡球虫病越来越得到人们的重视。通过肌肉、鼻腔、静脉、真皮、皮下及腹腔等不同接种途径进行免疫，免疫效果表明，肌肉注射和静脉注射效果最好。

本研究采用肌肉注射的方法是对14日龄雏鸡进行首次胸腺部位免疫，21日龄进行加强免疫。在28日龄称重后经口服感染1×105个E．tenella孢子化卵囊。36日龄宰杀所有鸡只，根据鸡只体内注射重组免疫毒素免疫后的盲肠病变记分、OPG、增重、结合抗球虫指数（ACI）等相关抗球虫感染指标检测，试验表明，重组蛋白可以显著减少盲肠病变记分和卵囊排出，抑制增重减少，相对增重率和卵囊减少率是评价鸡球虫疫苗免疫保护效果的两个重要的指标。不论应用药物处理还是使用疫苗进行免疫后，其目的都是削减虫卵卵囊的生成，使环境中的卵囊控制在非致病水平，因此目前以卵囊减少率作为

在鸡球虫病的免疫研究中评价保护效果的基本指标。结果显示，免疫毒素组的卵囊减少率达到40．78%，而相对增重率明显要比阳性对照组高。但免疫效果并不十分理想，饲养方式可能是一方面原因，地面平养鸡的生活条件会使垫料变湿，卵囊孢子化容易再次被鸡采食，造成再次感染；免疫间隔时间过短可能是另一方面原因，有研究成果表明，DNA疫苗必须进行多次加强免疫，但每次加强免疫间的间隔时间要相对较长［6］，Klotz等（2007）认为要获得理想的保护效果间隔时间最好能达到3～4周［7］。综合表明，重组免疫毒素对可诱导鸡体产生一定的抗球虫感染的免疫保护力。

［1］ ChaPman H D，Cherry T E，Danforth H D，Richards G，Shirley M W，Williams R B．Sustainable coccidiosis control in poultry production：the role of lives vaccines．Int J Parasitol，2002，32（5）：617－629．

［2］ 彭金彪．鸡柔嫩艾美耳球虫重组SO7抗原的免疫保护作用［D］．扬州：扬州大学，2007：5：64－65．

［3］ 王卉．鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌株SO7和TA4抗原基因的克隆与表达及免疫保护性试验［D］．杨凌：西北农林科技大学，2009：5：47－48．

［4］ 李安兴，蒋金书．柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）BJ株S07重组抗原的免疫试验［J］．中国兽医学报，2000，20（2）：167－170．

［5］ 彭维刚．鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1－a基因的克隆表达与免疫保护性试验［D］．杨凌：西北农林科技大学，2011，5：35．

［6］ 许金俊，陶建平，彭金彪，等．不同佐剂和免疫途径对柔嫩艾美耳球虫SO7抗原免疫保护效果的影响［J］．中国预防兽医学报，2007，29（9）：702－703．

［7］ Klotz C，Gehre F，Lucius R，Pogonka T．Identification of Eimeria tenella genes encoding for secretory proteins and evaluation of candidates by DNA immunization studies in chickens［J］．Vaccine，2007，25（36）：6625－6634．