发酵时间对酱渣厌氧发酵产酸的影响

齐希光，李秀芬

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 环境与土木工程学院，江苏 无锡 214122）

仅2010年，我国就产生了约470万t的酱渣（含水75%）。酱渣是指酿造酱油原料经制曲、发酵、淋出酱油后产生的固体残渣。据酿造原料不同，酱渣（干基）中含有约20%～30%粗蛋白、7%～18%粗脂肪、10%以上碳水化合物、20%～24%粗纤维、8%～12%水分、0.5%～2.0%盐分和丰富的矿物质，再利用价值很高。目前，酱渣主要是低价卖给农民用作肥料和饲料，但由于含盐度高，用量受到限制[1]。而其回收利用和深度加工尚处于研究阶段，主要集中在提取油脂、膳食纤维、黄酮和鲜味剂等成分，研究结果尚不理想。

有机废弃物厌氧发酵会产生多种挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）如乙酸、丁酸等，可作为发酵工业原料生产高附加值的发酵产品（如角质酶）[2-3]，或作为化工原料合成其他产品[4]，或作为微生物燃料电池的底物产电[5-6]，或用于废水脱氮除磷[7-8]。VFA的附加值远大于甲烷，据MICHAEL KR[9]估测，1t生物质可以生产价值150美元的乙酸，但只能生产出价值31美元的甲烷[9]。发酵时间是厌氧发酵产酸的重要参数之一。首先，厌氧发酵产酸是一个三阶段过程，随着发酵时间的推进，产物会不断转化，戊酸、丁酸、丙酸等可能会转化成乙酸，但乙酸也可进一步转化为H2、CH4、CO2等；其次，产物的过度积累可能会产生反馈抑制，吉布斯自由能降低，反应不再向正方向发生；最后，厌氧微生物生长繁殖也遵循生长曲线的3个阶段[10]：对数生长阶段、稳定生长阶段、内源呼吸阶段。

目前，生物质厌氧发酵产酸的研究主要集中在污水处理厂污泥、餐厨垃圾、蓝藻等的处理，而有关酱渣厌氧发酵产酸研究报道鲜见。通过优化酱渣厌氧发酵产酸的发酵时间，将酱渣中的有机成分尽可能多的转化成乙酸等挥发性脂肪酸，可在实现酱渣减量化的同时，生产高附加值产品，是获得良好环境和经济效益的有效途径。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

酱渣溶液浓度为100g/L，用4mol/LHCl和NaOH调节pH值至11.0，90℃预处理2h，离心后的上清液作为发酵产酸的底物，其中，可溶性蛋白质和碳水化合物的浓度分别为3.5g/L～5.0g/L和3.0g/L～4.0g/L。接种污泥为无锡市某污水处理厂的消化污泥，其有机物和总固体之比（VS/TS）为62.90%。将此污泥放入有效容积为2L的UASB反应器中驯化[11]，所得酸化接种污泥的VS/TS为71.21%。初始发酵pH值为9.0，发酵基质与微生物之比（F/M）比为5∶1。充3min氮气后橡胶塞密封，放入120r/min摇床中厌氧发酵[12-13]，发酵温度为35℃。

1.2 仪器与设备

2010 气相色谱仪：日本岛津公司；T6紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FE20pH计：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；CR21GII高速冷冻离心机：日本日立公司；HZ-2011KC汽浴摇床：太仓市华利达实验设备有限公司；UASB反应器：自制。

1.3 分析测试项目及方法

测定前样品预处理：取5mL厌氧产酸发酵液，8000r/min离心5min，用0.45μm的微滤膜过滤，取滤液0.5mL于离心管中，加入同体积0.835g/L的4-甲基戊酸溶液（作为内标）和同体积3mol/L的磷酸溶液（促使溶液中的VFA在进样室内气化），混匀，再次8000r/min离心5min，取1mL上清液装入气相色谱进样瓶，进岛津2010气相色谱仪检测。气相色谱测定参数：AOC-20i自动进样器；FID检测器；PEG-20M毛细管柱（30m×0.32mm×0.5μm）：大连中汇达科学仪器有限公司）；采用一阶程序升温，初温80℃，保持3min后，以15℃/min的速率升至210℃，保持2min。进样室和检测器的温度都设为250℃。

蛋白质含量采用考马斯亮蓝G250染色法测定[14]；碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法测定[15]。

2 结果与讨论

2.1 发酵时间对可溶性蛋白质浓度的影响

酱渣中含有占总固体20%～30%的粗蛋白，也是其预处理液中厌氧发酵产酸的重要底物，约为3.5g/L～5.0g/L，考察发酵前后蛋白质浓度的变化非常重要。发酵初期，底物与微生物发酵接触作用时间较短，底物的利用和转化率低，随发酵时间延长，微生物与底物的接触更为充分，有利于底物的代谢降解，相应地底物转化率增大。酱渣预处理液中蛋白质浓度随发酵时间的变化情况见图1。

由图1可见，蛋白质浓度随发酵时间的延长先快速下降，后基本稳定。发酵初期，酱渣预处理液中蛋白质浓度较高，约为3.5g/L，与微生物接触并吸收转化的几率大，蛋白质降解迅速，发酵2d时，蛋白质浓度就降低至1.2g/L左右，蛋白质降解率达62.52%。之后，随蛋白质浓度的降低，与微生物接触并吸收转化的几率随之下降，降解速度逐渐平稳，发酵至第8d时，蛋白质降解率为68.60%。发酵8d后，延长发酵时间对蛋白质降解转化的意义不大。

图1 发酵时间对蛋白质浓度的影响Fig.1 Influence of fermentation time on protein concentration

2.2 发酵时间对可溶性碳水化合物浓度的影响

酱渣中碳水化合物的含量在10%以上，其酱渣预处理液中的浓度约为3.0g/L～4.0g/L，相对而言，又易被微生物吸收利用，是厌氧发酵产酸的良好底物。可溶性碳水化合物浓度随发酵时间的变化规律见图2。

图2 发酵时间对碳水化合物浓度的影响Fig.2 Influence of fermentation time on carbohydrate concentration

由图2可见，与酱渣中蛋白质浓度的变化类似，随发酵时间的延长，碳水化合物浓度同样是先迅速降低，再呈平稳下降的趋势。在发酵初期，因可溶性碳水化合物浓度高，易与微生物接触并消化吸收，降解迅速，其浓度在2d内由2.90g/L降低为0.90g/L，碳水化合物浓度下降迅速，其降解率达68.33%。之后浓度趋于平稳，发酵至第8d时，碳水化合物降解率为81.21%，之后，降低不明显。另外，碳水化合物比蛋白质更易被产酸微生物降解利用，在相同条件下，其转化率比蛋白质高出约10个百分点，高浓度的可溶性碳水化合物有利于厌氧发酵产酸。

2.3 发酵时间对厌氧发酵末端产物浓度的影响

厌氧发酵末端产物的分布主要取决于各个生态因子综合作用下占主导地位的微生物种群的独立代谢途径，即一旦环境条件适于某一种群，该种群就会迅速占据主导地位，其生理代谢就决定了发酵末端产物的类型[16]。VFA是酸化阶段的主要产物，乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸可直接由碳水化合物及蛋白质发酵获得，更高分子量的挥发性脂肪酸，如正戊酸和异戊酸等主要由蛋白质发酵获得，因为对不含蛋白质的底物进行酸化研究发现，不生成正戊酸和异戊酸。酱渣预处理液厌氧发酵产酸分布随发酵时间的变化情况见图3。可以看出，末端发酵产物分布随发酵时间的延长先增加后降低，发酵产物包括乙醇、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、戊酸等。发酵至第8d时，总发酵末端产物浓度最高，为28.82g/L，相应地，乙酸浓度也在此时达最大，为22.91g/L。之后，随发酵时间持续延长，有机酸浓度转而下降，至第22d时，总酸浓度降低到2.10g/L。结合图1和图2中可溶性蛋白质及碳水化合物浓度随发酵时间的变化规律，可知，当蛋白质和碳水化合物浓度较低时，有机酸被微生物作为基质再利用，其浓度开始迅速下降。因此，从厌氧产酸的角度，8d的发酵时间较为合适。

另外，除乙酸外，相对于其他有机酸，无论在什么发酵时间，厌氧产酸过程中均存在明显的丙酸累积现象，发酵8d时丙酸累积量最高，约为5.00g/L。在厌氧产甲烷过程中，也常出现丙酸累积现象。有机物的厌氧消化主要是在水解发酵产酸菌群、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等不同微生物类群的协同作用下逐步完成的。其中，产氢产乙酸菌群将产酸发酵菌群代谢产生的丙酸、丁酸、乙醇等转化为乙酸、氢气和二氧化碳。然而，从生化反应的能量学角度分析，丙酸的产氢产乙酸代谢是所有VFA厌氧氧化中最难发生的反应，因在标准状态下，丙酸被转化为乙酸反应的吉布斯自由能达76kJ/mol[17]，为正值，不能自发进行，因此，丙酸常在厌氧消化系统中累积[18]。

图3 发酵时间对厌氧酸化产物浓度及分布的影响Fig.3 Influence of fermentation time on the concentration of anaerobic acidogenic products and their distribution

2.4 发酵时间对乙酸百分比的影响

乙酸可作为微生物燃料电池的底物产电，乙酸还可化学合成醋酸乙烯，醋酸乙烯是合成工业塑料的单体，也可化学合成醋酸纤维素，再进一步转化为乳胶涂料、色素等，是重要的化工原料。因此，通常希望厌氧发酵产生的有机酸以乙酸为主。乙酸百分比随发酵时间的变化情况见图4。

图4 发酵时间对乙酸百分含量的影响Fig.4 Influence of fermentation time on the percentage of acetic acid

由图4可见，在整个发酵过程中，乙酸都是主要发酵末端产物，占总末端发酵产物比例较高，在60%～80%左右，总体随发酵时间的增加而增加，后趋于稳定，发酵8d时，乙酸占总有机酸的比例达到最大，为79.49%。因此，发酵时间8d最优。

3 结论

（1）酱渣预处理液中可溶性蛋白质和碳水化合物浓度随发酵时间延长，先快速降低后逐步趋缓，发酵8d后基本稳定。发酵初期，可溶性蛋白质和碳水化合物等主要产酸有机底物迅速降解转化，发酵2d时其降解率分别为62.52%和68.33%，第8d时则分别为68.60%和81.21%。相对而言，可溶性碳水化合物是较好的发酵产酸底物。

（2）随发酵时间延长，发酵产生的总有机酸和乙酸浓度先增加后降低，并在第8d时取得最大值，分别为28.82g/L和22.91g/L，在可溶性底物被逐步消耗时，所产有机酸被微生物作为底物吸收再利用。乙酸是主要产物，占总酸比例为79.49%。厌氧产酸过程中存在一定量的丙酸累积现象，发酵8d时丙酸累积量最高，约为5.00g/L。

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