藏灵菇源酵母菌和乳酸菌降胆固醇蛋乳发酵饮料的研制

张 晶，张红星，谢远红，刘 慧*

（1.北京农学院 食品科学与工程学院，北京 102206；2.农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206）

随着生活水平的不断提高，人们对饮料产品的功效要求越来越高。国内外已有蛋乳发酵饮料研制成功的报道，但大多利用普通酸奶菌种研制而成，并没有降低胆固醇的功效。藏灵菇中含有60%～70%的乳酸菌，其他为酵母菌、醋酸菌等[1]。人们直接将藏灵菇添加到经加热灭菌，冷却后的牛乳中，使之发酵而生成具有酸味和起泡性的酒精性保健饮料[2]，长期饮用该种饮料可以调节血清胆固醇水平，改善动脉硬化，预防心脏病等病症。刘慧等[2-6]研究表明，藏灵菇源马克斯克鲁维酵母菌M3、干酪乳杆菌KL1、嗜热链球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4菌株在体内、体外具有较强的降胆固醇功效。有关利用藏灵菇源乳酸菌和酵母菌制备降胆固醇蛋乳饮料尚未见国内外文献报道。降胆固醇蛋乳饮料是以鸡蛋和牛奶为原料，采用藏灵菇源乳酸菌和酵母菌进行二次混合发酵研制而成的，亚健康人群通过饮用该种饮料可达到预防高胆固醇血症的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种：马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）M3、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、Tx干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）KL1、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis）KS4，均从吉林藏灵菇中筛选得到，并鉴定为产生胆盐水解酶[7-9]，具有降低胆固醇功能的菌株。

材料：新鲜鸡蛋、蒙牛纯牛奶、绵白糖（市售）。

试剂：邻苯二甲醛、无水乙醇、冰醋酸、浓硫酸、甲醇、氯仿、胆固醇、氢氧化钠（分析纯）。

1.2 仪器与设备

BCD-301型冰箱：青岛海尔；LS-B5OL型立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备厂；GHP-9160型隔水式恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SW-LJ-IFD型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；BS224S型分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；HZS-HA型水浴振荡器：哈尔滨市东明医疗仪器厂；DT-10d型高精度循环恒温水浴槽：北京德天佑科技发展有限公司；22PC型可见分光光度计：上海棱光技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵液的制备

（1）乳酸菌发酵液的制备

将活化好的KL1、Tx、KS4三株菌按2%的接种量分别移入灭菌牛奶三角瓶中，37℃培养12h。一次发酵接种前将3株菌按1∶1∶1的比例混合使用。

（2）酵母菌发酵液的制备

将活化好的M3菌种按1%～2%的接种量移入灭菌牛奶三角瓶中，28℃培养20h～24h备用。

1.3.2 饮料的工艺流程

1.3.3 降胆固醇蛋乳发酵饮料二次发酵条件确定

（1）发酵温度的选择：一次发酵（乳酸菌发酵）条件：3%总接种量，接种比例KL1∶KS4∶TX=1∶1∶1，43℃发酵8h。二次发酵（酵母菌发酵）M3菌株接种量为2%，发酵时间为24h，发酵温度分别为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，每组3个重复。将产品4℃后熟24h，以感官评分为试验指标确定发酵温度。

（2）发酵时间的选择：在上述试验结果基础上，M3菌株接种量为2%，发酵时间分别为20h、24h、28h、32h、36h，每组3个重复。将产品4℃后熟24h，以感官评分为试验指标确定发酵时间。

（3）接种量的选择：在上述试验结果基础上，M3菌株接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%，每组3个重复。将产品4℃后熟24h，以感官评分为试验指标确定接种量。

1.3.4 正交试验优化二次发酵条件

选择发酵温度、发酵时间、接种量为试验因素，采用3因素3水平正交试验优化二次发酵条件，以后熟前后感官评分为试验指标确定降胆固醇蛋乳发酵饮料最佳发酵条件。

表1 蛋乳发酵饮料发酵条件优化正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of egg and milk beverage

1.3.5 试验指标测定方法

（1）酸度的测定

方法见参考文献[10]。

（2）感官评分标准

选经过训练的10人根据感官评分标准对产品进行感官评价。评分标准（满分为20分）如下：

A、B、C、D四种指标，分别为色泽、口感、滋味、香气，每项满分5分，总共20分。

A色泽：色泽呈现出蛋乳的纯色4～5分，色泽过黄或偏白0～3分；B口感：口感细腻、幼滑4～5分，口感粗糙有结块0～3分；C滋味：酸甜适中、无涩味4～5分，滋味偏淡、无明显特点2～3分，酸甜不适、有明显涩味0～1分；D香气：有明显醇香和奶香4～5分，醇香气味较淡0～3分。

（3）酒精度的测定

方法见参考文献[10]。

（4）胆固醇的测定

①胆固醇含量标准曲线的绘制：胆固醇及其脂类在硫酸作用下与邻苯二甲醛产生紫红色物质，此物质在波长550nm处有极大吸收，用比色法测定总胆固醇含量。按表2操作加入各种试剂于比色管中，在20℃～37℃静置10min[11]。以试剂空白调零，立即于紫外可见分光光度计波长550nm处测定吸光度值，并绘制标准曲线，建立胆固醇含量与A550nm值线性回归方程为y=0.0026x+0.0364（R2=0.9943）。

表2 标准曲线溶液的配制Table 2 Solution preparation of standard curve

②邻苯二甲醛法测定蛋乳发酵饮料中胆固醇含量：试管中加入发酵蛋奶样品1.00g，然后加入2mL～3mL甲醇氯仿混合液，混匀，于45℃水浴加热15min，过滤于具塞比色管，并补充甲醇氯仿混合液至10mL。取上述样品处理液0.4mL，然后加入1000mg/L邻苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL，在20℃～37℃静置10min。以试剂空白（甲醇氯仿混合液0.4mL、邻苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL）调零，于波长550nm处测定样品的吸光度值，根据线性回归方程计算样品胆固醇含量，再计算胆固醇的降低率。

2 结果与分析

2.1 降胆固醇蛋乳发酵饮料二次发酵条件确定

2.1.1 发酵温度的确定

图1 发酵温度对产品感官品质的影响Fig.1 Effects of fermentation temperature on sensory quality of the product

酵母菌最适生长温度一般为25℃～28℃，不同发酵温度影响菌体产生的酒精含量，进而影响饮料感官指标[12]。由图1可知，34℃时产品感官评分最高，口感细腻，酸甜适宜，醇香浓郁；30℃和32℃时产品口感粗糙，醇香过浓，感官评分较低；26℃和28℃时产品口味不协调，滋味偏淡，感官评分最低。

2.1.2 发酵时间的确定

图2 发酵时间对产品感官品质的影响Fig.2 Effects of fermentation time on sensory quality of the product

不同发酵时间影响酵母菌产生的酒精含量。发酵时间过短时，产生的酒精含量较少；发酵时间过长时，会使菌体发生自溶，产生酵母臭味，导致产品风味变劣。由图2可见，发酵24h的产品酸甜适中，醇香适宜，口味协调；20h时由于发酵时间太短，产品滋味、醇香气味较淡；28h、32h、36h时产品口感及风味较差。

2.1.3 接种量的确定

不同接种量影响酵母菌产生的酒精含量。接种量过低，产生酒精含量较少；接种量过高，后期产生酒精含量过多，导致产品风味变劣。由图3可知，接种量为1%时的饮料口感最好且香气怡人，接种量为2%～5%时产品口感及风味较差。

2.2 正交试验优化二次发酵条件

影响饮料感官指标的主要因素有发酵时间、发酵温度、接种量等，根据R值大小可以直观分析试验因素的主次顺序，再利用方差分析进行检验。由表3可知，RB＞RA＞RC，RB'＞RA'＞RC'，即发酵时间是影响产品感官指标的主要因素，发酵温度次之，接种量影响最小。由表4、表5可见，不同发酵温度和发酵时间对产品感官指标影响极显著（p＜0.01），接种量对产品感官指标影响不显著。由表4可知，KA3＞KB2＞KC1，KA3'＞KB2'＞KC1'，二次发酵条件最佳组合为A3B2C1，即发酵温度34℃，发酵时间24h，接种量1%。在此最佳条件下，产品感官评分为18分。

图3 接种量对产品感官品质的影响Fig.3 Effects of inoculum on sensory quality of the product

表3 蛋乳发酵饮料发酵条件优化正交试验结果与分析Fig.3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of egg and milk beverage

2.3 产品酸度测定

由图4可见，产品后熟前后的酸度变化不大，说明藏灵菇源乳酸菌后熟期间产酸缓慢，有助于解决产品后酸化过快，导致乳品感官质量下降及保质期短等问题，从而保证产品质量。

表4 后熟前正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results before post-fermentation

表5 后熟后正交试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results after post-fermentation

图4 产品后熟前与后熟后酸度对比Fig.4 Comparison of acidity between before and after post-fermentation

2.4 产品胆固醇和酒精度含量的测定

表6 产品胆固醇含量测定结果Table 6 Determination results of cholesterol content of the product

表7 产品酒精度测定结果Table 7 Determination results of alcoholic content of the product

由表6可知，一次发酵前、一次发酵后、二次发酵后熟前后，胆固醇含量明显下降，说明藏灵菇源乳酸菌和酵母菌在发酵过程中代谢产生胆盐水解酶[13-15]，从而降低了原料中的胆固醇。由于酵母菌在二次发酵过程中代谢产生大量的胆盐水解酶，因而二次发酵后熟前比一次发酵的胆固醇含量降低了38.96个百分点；饮料后熟后的胆固醇含量比后熟前又下降了3.22个百分点，说明低温有利于胆盐水解酶的产生。由表7可知，产品酒精度为0.5g/100mL～1.0g/100mL，且后熟前后酒精含量变化不大，适合众多人群饮用。

3 结论

3.1 发酵时间是影响产品感官指标的主要因素，发酵温度次之，接种量影响最小。通过正交试验确定二次发酵最佳条件为发酵温度34℃，发酵时间24h，接种量1%。

3.2 通过乳酸菌一次发酵和酵母菌二次发酵，产品胆固醇含量的降低率分别为32.81%和71.77%，二次发酵后熟之后的胆固醇含量降低率为74.99%，说明藏灵菇源酵母菌M3菌株具有良好的降胆固醇作用。

3.3 产品酒精度为0.5g/100mL～1.0g/100mL，且后熟前后酒精含量变化不大，适合众多人群饮用。产品色泽柔和，呈乳黄色，淡淡的奶香伴着醇香，口感酸甜适中，是一种集营养与保健为一体的功能性饮料。

[1]岳 春，马长新，杨慧静.藏灵菇菌发酵麦芽汁饮料的研究[J].中国酿造，2012，31（8）：183-184.

[2]刘 慧，熊利霞.藏灵菇中高产胞外多糖乳酸菌的筛选及其发酵性能的研究[J].食品科学，2007，28（5）：211-215.

[3]刘 慧，陈湘宁，张红星，等.藏灵菇酵母菌M3耐胃肠道逆环境特性及降胆固醇的实验研究[J].中国农学通报，2009，25（15）：60-63.

[4]LIU H,XIONG L X,ZHANG H X,et al.Effect and mechanism of cholesterol-lowering byKluyveromycesfrom Tibetan kefir[J].Adv Mater Res，2012，343-344：1290-1298.

[5]LIU H,XIE Y H,ZHANG H X,et al.Studies on the action mechanism for cholesterol-lowering ofLactobacilluswhich yields bile salt hydrolase from kefir grains[J].Adv Mater Res，2013，781-784：1336-1340.

[6]刘 慧，王世平，张红星，等.藏灵菇源酸奶复合菌发酵剂对大鼠肝脏胆固醇的作用[J].中国食品学报，2010，10（2）：35-39.

[7]刘 慧，潘昌莉，张红星，等.蔵灵菇源克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶的特性研究[J].中国农学通报，2009，25（24）：102-107.

[8]刘 慧，熊利霞，张红星，等.藏灵菇源干酪乳杆菌KL1高产胆盐水解酶发酵条件的优化研究[J].中国农学通报，2008，24（12）：114-118.

[9]刘 慧，杜 薇，张红星.乳酸乳球菌乳酸亚种高产胆盐水解酶发酵条件的优化研究[J].食品科学，2006，27（11）：322-326.

[10]刘 慧.现代食品微生物学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2006.

[11]丁卓平，王明华，刘振华，等.食品中胆固醇含量测定方法的研究与比较[J].食品科学，2004，25（1）：130-135.

[12]金 慧，刘荣厚.温度对固定化酵母酒精分批发酵的影响及动力学模型[J].农业工程学报，2009（25）：258-261.

[13]韩俊华，盛晓甘，张柏林，等.乳酸菌降胆固醇作用研究现状[J].中国乳品工业，2002（3）：16-20.

[14]潘昌莉，张红星，刘 慧，等.藏灵菇源克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶的分离纯化研究[J].中国酿造，2011，30（3）：58-62.

[15]王玉文，王延祥，李平兰，等.胆盐水解酶的分离纯化与部分特性研究[J].中国食品学报，2007（7）：36-40.