α-葡萄糖苷酶的制备工艺研究进展

严晓娟，陈 朋，2*，梁 宁，胡先望

（1甘肃省商业科技研究所，甘肃兰州，730010；2兰州大学药学院，甘肃兰州，730020）

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC.3.2.l.20）系统命名为α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，又名α-葡萄糖基转移酶或麦芽糖酶，简称α-糖苷酶。其在糖的催化反应方面具有水解和转糖苷双重作用，可从α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非还原性末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖或将游离出的葡萄糖残基以α-1，6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的异麦芽低聚糖（isomalto-oligosaccharides，简称IMO）、糖脂或糖肽等[1]。α-葡萄糖苷酶在自然界广泛分布，种类繁多，几乎存在于所有生物体内。在人类的糖原降解及动物、植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。目前，α-葡萄糖苷酶已广泛应用于基础和开发研究领域，主要包括生产低聚异麦芽糖、淀粉水解、酒精发酵、代谢机理研究、食品成分分析和医学诊断等方面[2]。

不同来源的α-葡萄糖苷酶相对分子质量差异很大，一般为40000u～150000u。pH值为3.0～5.0，但最适pH值可以超过7.0；多数具有较高的热稳定性和最适温度，属于键专一性酶，可专一性地切开糖类底物分子中的α-1，4糖苷键，个别种类的也可以作用于蔗糖的α-1，2糖苷键[3]。

1 α-葡萄糖苷酶的制备与提取

1.1 从植物中提取

植物中提取α-葡萄糖苷酶常用的方法包括醇法、水-醇法、醇吸附树脂法、醇提-醚（酮）沉淀法、透析法、氧化镁吸附法、葡聚糖凝胶法、大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法等[3]。从植物中提取α-葡萄糖苷酶的报道很少。

1.2 微生物发酵

目前，国外生产的α-葡萄糖苷酶大部分为纯酶，酶活较高，而国内对α-葡萄糖苷酶的研究集中在产酶菌株的诱变选育、分离纯化、固定化酶、酶学性质和基因工程菌方面[4-5]，主要以粗酶液为主，酶活较低。已开发的α-葡萄糖苷酶主要来源于黑曲霉、米曲霉、地衣芽孢杆菌和酵母，其中产酶较高的是黑曲霉[6-9]。将N+注入出发菌株诱变得到一株柠檬酸高产菌株黑曲霉LD20，将其在500L发酵罐中进行发酵实验，在35℃、300r/min、24h的发酵条件下，α-葡萄糖苷酶最高酶活可达到322.52U/mL[10]。实际生产中的α-葡萄糖苷酶主要来源于真菌，由于真菌的发酵周期较长，酶的产量和特性不易控制，所以构建和利用基因工程菌作为生产该酶制剂的宿主，成为该酶的研究热点。α-葡萄糖苷酶基因的来源主要集中在嗜热菌属、曲霉属、芽孢杆菌属、肠杆菌等，表达所选用的宿主大多为大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和其他丝状真菌等。从阪崎肠杆菌（ATCC29544）中克隆到α-葡萄糖苷酶基因malA，将其克隆入表达载体pET22b（+），构建重组表达质粒pET22b-malA。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），得到的克隆的目的基因全长1677bp，与Genbank的malA比较具有100%的同源性[11]。从肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesentcroidesATCC 8293）里克隆到编码糖苷酶家族3保守区段的基因（Leum-0289），将该基因插入到表达载体pET28a（+）中，得到的重组α-葡萄糖苷酶具有高度的专一性，只能水解合成底物p-NPG[12]。

2 α-葡萄糖苷酶的纯化

酶纯化的常用方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、疏水层析色谱、超滤技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳等[13]。其中，盐析和有机溶剂沉淀常用于酶的初级纯化阶段，离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等方法，对于酶更高级别的纯化效果好，常用于重组α-葡萄糖苷酶的分离纯化，同时将几种分离纯化方法结合使用，能达到更理想的分离纯化效果[14]。

2.1 硫酸铵沉淀

硫酸铵沉淀法是大部分酶在初级纯化阶段经常采用的方法。由于硫酸铵沉淀对酶的活性损伤少，沉淀可长时间保存，又可除去大部分杂蛋白，所以目前酶初纯阶段大多采用硫酸铵分级沉淀，该法纯化操作简单，成本低廉，温度系数小，不易使蛋白质变性，但是分辨力差，酶中混杂大量盐分，纯化倍数不高[15]。

2.2 冷丙酮沉淀

在冰浴条件下，向酶抽提液中边搅拌边加入不同体积比的冷丙酮（-15℃），根据各种蛋白质的溶解度不同，利用不同浓度的丙酮来沉淀不同的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。该法分辨率高，可除去大量的杂蛋白和色素物质。

2.3 离子交换层析

离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法，该法灵敏度高、重复性好、选择性强、分析速度快，被广泛应用于酶和蛋白质的分离纯化中，常用于重组α-葡萄糖苷酶的分离纯化。刘军等[16]从嗜热栖热菌Thermus thermophilus中克隆耐热α-葡萄糖苷酶基因hbg及在大肠杆菌中高效表达，采用镍亲和柱-阴离子交换柱纯化重组表达的α-葡萄糖苷酶，经SDS-PAGE分析表明，经诱导的重组菌有明显的重组蛋白表达带，纯化后可见一条单一蛋白带，预期分子量为61.798ku。郎国竣等[17]采用HD-1大孔酚醛系弱酸性阳离子交换树脂柱层析、HZ806大孔吸附树脂柱层析、高效液相制备色谱等对编号为506157菌株次级代谢产物的活性成分进行分离纯化，得到的抑制剂纯样品纯度可达95%以上。袁亚宏等[18]比较了Q-Sepharose Fast Flow和DE-52这两种阴离子交换柱对1株Alicyclobacillus contaminans发酵产生的α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果，发现经过Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱分离效果优于DE-52层析柱。

2.4 亲和层析

将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，达到分离纯化的目的。该法纯化能力强大，活性蛋白的回收率高，可纯化其他方法难以分离的蛋白质[14]。常用于重组α-葡萄糖苷酶的分离纯化。杨捷琳等[12]克隆获得了阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因，通过构建pET22b（+）-Glu表达质粒转化大肠杆菌获得基因重组的高表达菌株，采用Ni-NTA亲和柱纯化目的蛋白，纯化后纯度达到了90%以上。

2.5 凝胶过滤层析

利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。该法操作条件温和，不需要有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。常用于α-葡萄糖苷酶的分离纯化。毕金峰等[19]探讨了一种黑曲霉所产α-转移葡萄糖苷酶粗酶的分离提纯方法，采用葡聚糖凝胶G2200柱层析法分离粗酶液，用SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯酶的分子质量为130ku。

3 α-葡萄糖苷酶活性的测定

α-葡萄糖苷酶活力单位定义各异，按QB2525-2001《食品添加剂α-葡萄糖转苷酶》，酶活定义为1mL酶制剂于40℃、pH 5.0的条件下，1h作用α-甲基-D-葡萄糖昔生成1μg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U/mL）。袁亚宏等[18]研究的α-葡萄糖苷酶活的测定方法：1个酶活力单位（U）为52℃、pH 5.4条件下，1min催化产生1μmol对硝基苯酚需要的酶量。陈健旋等[20]研究的α-葡萄糖苷酶活测定方法：以每小时生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个单位，再测定湿固体曲水分，然后折算成U/g（干曲）表示其酶活。杨捷琳等[21]利用α-葡萄糖苷酶能够分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性，在阪崎肠杆菌显色培养基上检测表达纯化后的蛋白活性。毕金峰等[22]用直接滴定法测定α-转移葡萄糖苷酶作用于一定浓度的底物生成产物还原糖的量，用消耗反应液体积来间接反映α-转移葡萄糖苷酶的酶活。

4 展望

目前，国内对α-葡萄糖苷酶研究主要集中在生产菌种的诱变选育、分离纯化、固定化酶、酶学性质和基因克隆表达等方面。微生物发酵是α-葡萄糖苷酶产业化的基础，研究其生化性质、转糖苷反应条件、纯化方法，优化发酵工艺和改造酶的特异性等方面，具有重要的理论和应用价值。由于国内工业化生产α-葡萄糖苷酶的酶活很低，如何通过跨界融合技术、多重因素设计高效低成本的表达系统，研究酶的结构与功能以及酶的固定化技术，对提高α-葡萄糖苷酶的研究至关重要。

表1 微生物提取α-葡萄糖苷酶Table 1 Microbial extraction of α-glucosidas

表2 α-葡萄糖苷酶的纯化方法Table 2 This methods of purification of α-glucosidas

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