硝酸盐对畜粪秸秆体系厌氧发酵产沼气的影响

谢 婷，饶康太，陈 雄，高顺清，鲁 江，王 志*

（1.湖北工业大学，湖北 武汉 430068；2.深圳华润九新药业有限公司，广东 深圳 518049）

农业废弃物的增益化利用是循环生态农业非常重要的环节，随着我国农业的发展，每年7亿t的作物秸秆产量和预计到2020年将达到42亿t的畜粪年排放量成为生态农业资源化利用以及可持续发展亟待解决的问题和研究热点[1]，如秸秆、畜粪等农业废弃物在厌氧条件下转化为沼气的研究[2-3]。虽然秸秆中存在纤维素和木质素等分子形成的特殊结构[4]和木质素芳环降解物对厌氧菌群的毒性[5]以及畜粪秸秆厌氧体系易于“基质酸化”等而使沼气产量的稳定性降低[6]，但是纤维素、木质素等大分子还是可以被厌氧耦合菌系有效降解[7]。“基质酸化”从本质上是厌氧体系细菌发酵产生的乙酸等小分子有机酸的能力大于甲烷菌群利用其为碳源和能源来合成甲烷的能力所造成[8]，因此可以通过大量补加产甲烷菌[9]和向酸化体系中补加能利用畜粪厌氧产氨的细菌[10]来缓解碳代谢失衡而降低酸化程度，但是由于两者纯培养的技术难度妨碍了其大规模应用。

厌氧条件下，多数兼性厌氧菌（如芽胞杆菌、大肠杆菌、粪产碱菌、假单胞菌等）能将有机物氧化放出的电子传递给硝酸盐同时释放能量[11]。当没有硝酸盐或其可获得性不足时，兼性细菌可通过发酵作用将电子直接传递给中间产物，产生乙酸等小分子有机酸，而其在厌氧体系中被甲烷菌系利用而产生甲烷。当该代谢耦合作用失衡时，酸化由此产生[8，12]。因此，硝酸盐的可获得性可能成为缓解或解决秸秆畜粪厌氧体系产沼气系统酸化的易行方法。本文在秸秆畜粪厌氧发酵体系中添加硝酸盐和兼性产氨菌株，考察其对厌氧发酵过程中基质利用、体系pH值和挥发性脂肪酸（VFA）代谢以及沼气产量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 发酵原料

水稻秸秆（含水率小于10%），粉碎后过40目筛后备用。新鲜牛粪（总固形物含量TS为15.6%）或/和猪粪（总固形物含量TS为13.9%）。

1.1.2 实验装置

采用橡胶塞封口的250mL抽滤瓶作为反应器，出气口连接橡胶管并浸没固定于15%NaOH溶液的量筒内。抽滤瓶位置高于量筒，以免倒吸。反应器置于37℃恒温水浴锅中。

1.2 方法

1.2.1 发酵体系装配

自然厌氧发酵体系：5g秸秆粉装入250mL的抽滤瓶中，添加牛粪或/和猪粪（牛粪和猪粪混合时，其比例为2∶1）30g，加蒸馏水200mL后立即将瓶口用橡胶塞封闭，出气橡胶管固定于集气装置。

以兼性氨化菌为接种物的秸秆畜粪发酵体系：5g秸秆粉装入250mL的抽滤瓶中，添加牛粪和猪粪（混合比例2∶1）30g，接入在LB液体培养基中活化12h的兼性厌氧氨化菌——粪产碱菌（Af）或/和苏云金芽孢杆菌（Bt）30mL（Af生物量为1.6g/L，Bt生物量是1.8g/L），再加蒸馏水170mL后立即将瓶口用橡胶塞封闭，出气橡胶管固定于集气装置。

1.2.2 分析检测方法

产沼气量检测：采用水压法收集发酵产生的气体，根据排出的15%NaOH溶液的体积定时记录产气量。

发酵液pH值：用pH值计测定。

挥发性脂肪酸（VFA）的检测参照文献[13-14]的方法进行。

每组试验数据取3次重复实验的平均值。

2 结果与分析

2.1 秸秆畜粪（牛粪或/和猪粪）体系发酵产气及体系pH值情况

秸秆畜粪（牛粪或/和猪粪）体系自然发酵产气过程和最终pH值见图1、图2。

秸秆畜粪（牛粪或/和猪粪）体系自然发酵厌氧培养168h后培养体系的产气趋势基本相似，产气量随培养时间的延长而提高。牛粪、猪粪和牛粪/猪粪体系平均产气速率分别为0.68mL/h、1.31mL/h和1.22mL/h，后两者产气效率比前者分别提高了93%和79%。这与后两者所含成分比牛粪更富营养有关。如所分析的那样，三者在厌氧发酵过程中均发生了严重的酸化现象，三者的最终pH值为5.1～5.6。产气速率与pH值之间存在对应关系，酸效应的存在使得体系产气效率下降。新鲜牛粪中含纤维质比较多，而猪粪因含较多的蛋白类组分而缓解基质酸化的程度，提高了菌群甲烷合成能力。但是，体系酸化仍然发生了。以牛粪体系pH值最低（5.13），猪粪和牛粪/猪粪体系pH值差异不大，在5.5左右。由于研究目标是秸秆畜粪体系，因此选择牛粪/猪粪（2∶1）作为发酵体系底物之一。

图1 不同畜粪对体系厌氧发酵产沼气的影响Fig.1 Effect of straw and manure anaerobic fermentation system on the biogas production

图2 不同畜粪对体系厌氧发酵pH值的影响（平均值±标准偏差）Fig.2 Effect of straw and manure anaerobic fermentation system on pH value(Means±standard deviation)

基于对体系酸化机制的理解，通过补加前期筛选的兼性产氨细菌——粪产碱菌（Af）和苏云金芽胞杆菌（Bt，同时接种2株菌的接种比例为1∶1）以观察其对体系pH值和产气的影响。

2.2 兼性氨化菌对秸秆畜粪体系发酵产气及体系pH值的影响

体系接种粪产碱菌或/和苏云金芽胞杆菌，秸秆畜粪体系厌氧发酵最终产气量和pH值见图3、图4。

接种粪产碱菌或/和苏云金芽胞杆菌，秸秆畜粪体系厌氧发酵168h的产气趋势基本相似，产气量随培养时间的延长而提高，产气速率先加快，后逐渐减慢，最终产气量分别为205mL、195mL和220mL，后者分别比前两者提高了7.2%和12.8%。

图3 接种兼性氨化菌对秸秆畜粪体系发酵产气的影响Fig.3 Effects of facultative ammonifying bacteria addition on biogas production in the anaerobic straw and manure fermentation system

图4 兼性氨化菌对秸秆畜粪体系pH值的影响（平均值±标准偏差）Fig.4 Effects of facultative ammonifying bacteria addition on pH value in the anaerobic straw and manure fermentation system(Means±standard deviation)

添加粪产碱菌或/和苏云金芽胞杆菌菌液后体系pH值不同，其中同时添加粪产碱菌和苏云金芽胞杆菌体系的pH值最高，为5.83。添加粪产碱菌或苏云金芽胞杆菌的pH值相当，分别为5.70和5.76，均低于同时添加2种菌体系的pH值。

和图2相比，接种兼性氨化菌的厌氧发酵体系的pH值均高于自然厌氧发酵体系的pH值，提高了2.9%～13.6%，可见接种兼性氨化菌有利于提高体系pH值，但pH值的缓冲效果仍然不理想，pH值仍在6.0以下。

由于在厌氧条件下，兼性厌氧菌如粪产碱菌和芽胞杆菌等能通过硝酸盐呼吸来产生能量[11]及可能降低或缓解发酵产酸效应。因此，选择牛粪/猪粪（2∶1）和接种兼性产氨细菌——粪产碱菌和苏云金芽胞杆菌为基本厌氧体系，观察硝酸盐和氨化菌接种量对体系pH值的影响。

2.3 硝酸钾对秸秆畜粪接种氨化菌体系发酵产气及体系pH值的影响

由于硝酸钾、氨化菌的复合作用可能调节体系厌氧发酵的pH值，稳定体系产气效率，因此，对两者进行了初步优化见表1。Af/Bt指粪产碱菌和芽胞杆菌接种菌液体积比例。

表1 加硝酸钾和氨化菌对pH值的影响Table 1 Effects of potassium nitrate and ammoniation bacteria additions on pH value

表2 双因素方差分析（α=0.05）Table 2 Variance analysis of two factor(α=0.05)

从表1可以看出，相同氨化菌接种比例时，体系pH值基本上都是随着硝酸钾添加浓度的增大而提高。硝酸钾浓度是1g/L和3g/L时，pH值基本上不随氨化菌接种比例的变化而变化。最优组合方案是：2g/L硝酸钾以及粪产碱菌/苏云金芽孢杆菌为1∶2。此条件下，体系最终pH值最高，为7.12。

由表2可知，运用Excel方差分析当α=0.05时，硝酸钾对体系pH值影响极为显著。氨化菌只是具有厌氧硝酸盐呼吸的能力，但是，当培养环境中硝酸盐的可获得性不足时，氨化菌并不能诱导并表现出硝酸盐呼吸的功能，因而其单独使用的缓冲pH值效果并不明显。

最优组合方案条件下体系产气和pH值的情况见表3。

表3 硝酸钾对秸秆畜粪接种兼性氨化菌体系发酵产气及体系pH值的影响Table 3 Effects of nitrate addition on biogas production and pH value in straw manure inoculated with the facultative ammoniation bacteria system fermentation

由表3可知，优化条件下厌氧发酵168h的产气量为350mL，比对照组（只添加氨化菌）显著提高了62.8%。培养结束时优化组VFA含量为2.54g/L，比对照减少了13.0%。这也反映出更多的挥发性有机酸被甲烷菌群利用了，体系VFA的降低显著缓冲了体系的pH值，发酵结束时，添加组pH值为7.12，比对照提高了22.8%。同时也表明：秸秆畜粪厌氧体系产沼气的限制性因子不是体系VFA的生成效率，而是VFA积累到临界浓度以上所造成的过低pH值。

硝酸钾的加入使兼性厌氧菌群（包括粪产碱菌和芽胞杆菌）在厌氧体系的电子受体可获得性增加，实现了电子由VFA合成途径向硝酸盐呼吸的代谢迁移[15-16]，缓冲了体系pH值，提高了厌氧菌系的代谢活性，促进了有机物向沼气转化的效率。

3 结论

秸秆畜粪（牛粪或/和猪粪）体系厌氧发酵过程发生了基质酸化现象，最终pH值为5.2～5.5，虽然接种兼性氨化菌的厌氧发酵体系比自然厌氧发酵体系的pH值提高了2.9%～13.6%，但体系pH值仍在6.0以下。当硝酸钾的添加量为2g/L以及氨化菌（粪产碱菌/苏云金芽胞杆菌的接种比例为1∶2）时，厌氧发酵168h的产气量为350mL，比对照组（只添加氨化菌）显著提高了62.8%，此时VFA含量为2.54g/L，比对照减少了13.0%。这也反映出更多的挥发性有机酸被甲烷菌群利用了，体系VFA的降低显著缓冲了体系的pH值，发酵结束时，添加组pH值为7.12，比对照提高了22.8%。

硝酸钾对体系pH值影响极为显著，而氨化菌只是具有厌氧硝酸盐呼吸的能力，但是，当培养环境中硝酸盐的可获得性不足时，氨化菌并不能诱导并表现出硝酸盐呼吸的功能，因而其单独使用的缓冲pH值效果并不明显。硝酸钾的加入提高了体系pH值和厌氧菌系的代谢活性，促进了有机物向沼气转化的效率。同时也说明秸秆畜粪厌氧体系产沼气的限制性因子不是体系VFA的生成效率，而是VFA积累到临界浓度以上所造成的过低pH值。

本研究结果为秸秆畜粪体系厌氧条件下因“基质酸化”而使沼气产量降低矛盾的解决提供了一种易行策略。

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