酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶活性及氧气对酵母产酶的影响

张方方，刘延琳*

（西北农林科技大学 葡萄酒学院/陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100）

酵母是葡萄酒发酵过程中起主要作用的微生物，它能将葡萄中的糖转化成酒精及其他代谢副产物，酿酒酵母是将葡萄糖转变成酒精的主要微生物[1-3]。

β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC3.2.1.21）是水解葡萄中糖苷的关键酶[4]，它存在于植物[5]，细菌、霉菌和酵母[6-8]中，植物和微生物中β-葡萄糖苷酶的水解能力取决于糖苷配基的结构和酶的来源[9]。有研究表明酿酒酵母能产生β-葡萄糖苷酶[10-13]，该酶能将葡萄中的非挥发性糖苷转化成挥发性的香气物质，提高葡萄酒香气复杂性，改善葡萄酒质量[6，14-15]。在葡萄酒发酵过程中，氧气不仅影响酵母的生长，同时对酵母的产酶也会产生影响[16]，因此本实验主要研究酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶活性及氧气对酵母产酶的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

分离自新疆和宁夏葡萄酒产区的7株酿酒酵母，分别是F-3-8、FS-3-10、H-1-19、HS-2-1、HS-2-31、HS-2-32和M4，1株国外引进的酿酒酵母UCD522。

1.1.2 主要试剂

对硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside），Sigma公司；咪唑（≥98.5%），Sigma公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠，天津博迪化工股份有限公司；还原态谷胱甘肽、Triton X-100，美国Amresco公司；甲苯、乙醇，西安三浦化学试剂有限公司；YPD液体培养基（葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L）。

1.2 仪器与设备

DK-S22电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；FRESC017型高速冷冻离心机，美国Thermo公司；UV1800紫外可见分光光度计，岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化与培养

在5mL YPD液体培养基中接种100μL酵母菌种，28℃，150r/min条件下培养24h。活化的菌株接种量为1%（v/v），接种至pH值为5 YPD液体培养基中，28℃，180r/min条件下培养24h，重复两次。取样测上清液，壁膜间隙，细胞内的β-葡萄糖苷酶。

1.3.2样品处理

上清液：取1mL酵母菌液，4℃，10000×g离心10min，取0.2mL上清液测β-葡萄糖苷酶。

壁膜间隙：取1mL菌液，在4℃条件下10000×g离心10min，1mL冷却无菌水洗菌体2次，加入0.2mL柠檬酸-磷酸缓（pH5，0.1mol/L）冲溶液，测酵母壁膜间隙β-葡萄糖苷酶。

细胞内：取1mL菌液，在4℃条件下10000×g离心10min，1mL冷却无菌水洗菌体2次，加1mL 75μmol/L pH值为7.5咪唑缓冲溶液，迅速加50μL，0.3mol/L谷胱甘肽，0.01mL 10%triton x-100，50μL甲苯/乙醇（1/4 v/v），剧烈震荡5min，4℃条件下10000×g离心10min，用1mL冷却无菌水洗菌体两次，加入0.2mL pH5柠檬酸-磷酸缓冲溶液，分析酵母的胞内酶[17-19]。

细胞干重：取4mL菌液，10000×g离心10min，冷却的无菌水洗菌体2次，105℃烘至恒重，分析天平称重。

1.3.3 酶活测定

分别将上一步得到的0.2mL初酶液加0.2mL底物pNPG（5mmol/L溶于pH5柠檬酸-磷酸缓冲溶液），30℃水浴反应1h，然后加pH值为10.2，0.2mol/L碳酸钠缓冲溶液终止反应，400nm下测吸光度值[19]。β-葡萄糖苷酶的酶活表示为每小时1mL菌液中反应生成的对硝基苯酚的μmol数。

1.3.4 厌氧条件对酵母产酶的影响

将活化的酵母接种至含有80%体积的YPD（pH5）液体培养基的离心管中，接种量为1%（v/v），28℃条件下静止厌氧培养72h，每个菌株重复两次。分别测上清液，壁膜间隙，细胞内的β-葡萄糖苷酶酶活。

2 结果与分析

2.1 不同菌株的β-葡萄糖苷酶活性差异

不同种类酵母的β-葡萄糖苷酶在酵母中的分布不同[20]，本研究测定了8株酿酒酵母的上清液，壁膜间隙和细胞内的β-葡萄糖苷酶酶活，酵母的β-葡萄糖苷酶是由这三部分酶相加所得。

本研究供试酿酒酵母菌株的β-葡萄糖苷酶活性见表1。由表1可以看出，酿酒酵母β-葡萄糖苷酶主要位于壁膜间隙和细胞内，菌株M4的β-葡萄糖苷酶最高，为4.10μmol pNP·mL-1·h-1。上清液中，F-3-8、FS-3-10、M4和UCD522这一组菌株酶活最高，与其他酵母上清中的β-葡萄糖苷酶差异显著（p＜0.05）。在细胞的壁膜间隙中，菌株M4的β-葡萄糖苷酶最高，占其总酶的43.90%。F-3-8、FS-3-10和M4这三株菌细胞内的β-葡萄糖苷酶较高，与其他的菌株具有显著性差异，其中M4的酶最高，占其总产酶的40.24%。

2.2 厌氧条件对酿酒酵母β-葡萄糖苷酶产酶的影响

葡萄酒酿造的过程中几乎是一个厌氧的过程，因此研究氧气对酵母产酶具有重要的意义。氧气不仅影响酵母的生长，也影响酵母的产酶[20]。表2表示厌氧条件下酿酒酵母上清液，壁膜间隙和细胞内的β-葡萄糖苷酶活性。厌氧条件下菌株M4的产酶最高，为0.91μmol pNP·mL-1·h-1，但仅占有氧条件下产酶的22.20%。上清中菌株F-3-8和FS-3-10产β-葡萄糖苷酶最高，分别为0.43和0.40μmolpNP·mL-1·h-1，其次是菌株M4。菌株M4壁膜间隙和胞内酶最高，其酶活分别为厌氧条件下酶的25.27%和35.16%，厌氧条件下M4的酶主要分布在上清和细胞内。

表1 酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶活性Table 1 β-glucosidase activity ofS.cerevisiae

表2 厌氧条件下酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶Table 2 β-glucosidase activity ofS.cerevisiaewith anaerobic condition

从附图可以看出在有氧条件下酵母合成的β-糖苷酶显著高于厌氧生长时产生的酶，表明氧气可以促进酵母β-葡萄糖苷酶的合成。

3 结论

对于8株酿酒酵母的研究表明菌株M4的产酶最高，相同种的菌株产酶不同，因此酵母的产酶具有菌株依赖性。β-葡萄糖苷酶主要位于酵母的细胞间隙和胞内，但是细胞内部的β-葡萄糖苷酶对糖苷的水解不能起作用，只有将β-葡萄糖苷酶分泌到壁膜间隙或细胞外部的环境中才能水解糖苷。

附图 氧气对酿酒酵母β-葡萄糖苷酶的影响Attached Fig.Effect of oxygen onS.cerevisiaeβ-glucosidase activity

葡萄酒的发酵是在厌氧条件下进行的，氧气不仅影响酵母的生长，而且对酵母的产酶也有影响，有氧条件能促进酵母产酶。有氧条件下菌株M4上清液，壁膜间隙和细胞内酶活分别是厌氧条件产酶的1.81，7.83和5.16倍，分别为0.65，7.83和5.16μmol pNP·mg-1·h-1。葡萄酒发酵过程中适当通气，有益于提高β-葡萄糖苷酶的产生，从而调控香气的生成，影响葡萄酒的感官质量。

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