乳酸菌发酵蟹壳脱钙的菌株筛选及条件优化

张建平，曹海龙*，赵 勇，李曙光，岳 敏，刘 航，尹 恒，杜昱光

（1.中国科学院 大连化学物理研究所，辽宁 大连 116023；2.中国科学院大学，北京100049）

几丁质俗称甲壳素，又名壳多糖、聚乙酰氨基葡萄糖、甲壳质等，是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接的一种天然高分子多糖，广泛存在于虾、蟹、昆虫等甲壳动物的外壳、软体动物的器官、以及细菌、真菌和植物的细胞壁中。在自然界中，几丁质作为一种天然高分子多糖，其蕴藏量及年产量仅次于纤维素。由于几丁质及其衍生物在农业、医药、食品、环保、轻纺和日化等领域均有广泛的应用，因此催生出了一个开发利用几丁质及其相关产品的巨大产业[1-3]。

目前，国内外主要以虾蟹壳为原料，采用强酸强碱来分别脱除虾蟹壳中的碳酸钙和蛋白的传统方法生产几丁质。此过程由于消耗大量的酸碱，往往会导致严重的环境污染问题，严重制约了几丁质产业的发展，因此开发出绿色清洁的几丁质生产工艺对几丁质产业的健康发展至关重要[4]。

研究表明，采用生物发酵法生产乳酸来脱除虾蟹壳中的碳酸钙是一种行之有效的替代方法，是目前几丁质绿色清洁生产工艺研究的热点。由于乳酸菌发酵过程中会产生大量的乳酸[5]与虾蟹壳中的碳酸钙反应产生可溶的乳酸钙，且还可通过菌体产生蛋白酶脱除虾蟹壳中的蛋白，使得这种方法不但对环境造成的污染小，而且还能在几丁质的生产过程中回收大量的有机钙、蛋白和一定的色素[6]。目前，在国内外研究报道中，利用生物发酵法进行虾蟹壳脱钙研究所采用的微生物菌株主要为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等[4，7-8]，且大多数研究以虾壳原料为主，仅有少数研究采用蟹壳为原料。

基于乳酸菌具有较好的生物发酵脱钙能力，本文对15株乳酸菌菌株进行了发酵蟹壳脱钙的初步考察，并对筛选出的具有较高发酵蟹壳脱钙能力的菌株进行了接种量、糖浓度和发酵时间等单因素的实验，以期为该菌株发酵蟹壳脱钙的进一步研究和工业化应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

见表1，其中菌株6032来自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），其余来自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

表1 乳酸菌菌株信息Table 1 The information of lactic acid bacteria

1.1.2 原料

蟹壳，由大连中科格莱克生物科技有限公司提供。

1.1.3 培养基

MRS培养基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1mL，用去离子水定容至1L，调pH为6.5；固体培养基需添加2%的琼脂粉。

发酵培养基：蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，葡萄糖0～125g，蟹壳50g～300g，用去离子水定容至1L。

1.1.4 主要仪器

箱式电阻炉购自山东省龙口市先科仪器有限公司，QHZ-98A全温振荡培养箱购自太仓市华美生化仪器厂，DHG-9140A型电热鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司，实验室pH计购自梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司，电子天平购自梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化与种子培养

将保存于-80℃的乳酸菌划线于新配制的MRS固体培养基进行活化，培养温度为30℃，时间为2d。之后再将菌体划线转接于新固体培养基30℃培养2d。取活化好的菌株，接种1环至30mL MRS液体培养基（100mL锥形瓶），于30℃振荡培养箱中150r/min培养20h作为种子备用。

1.2.2 原料预处理

蟹壳经粉碎后过40目筛，取大于40目部分（0.6mm～4mm）于105℃干燥5h备用。

1.2.3 菌株的筛选

将15株乳酸菌种子液分别接种至发酵培养基（100mL·250mL-1锥形瓶）中，接种量为10%（种子培养基OD600值达到4～5），于30℃振荡培养箱150r/min培养7d。发酵结束后，将蟹壳过60目筛洗净，于105℃干燥箱中恒温干燥至恒重，称重并测其灰分含量，筛选出脱钙率最高的菌株。

1.2.4 脱钙率的测定方法

采用测灰分的方法[9]测定脱钙率。将发酵后的蟹壳过60目筛洗净，于105℃干燥箱中恒温干燥至恒重，测其质量记为M1（g）。之后于箱式电阻炉中550℃灼烧3h，测其灰分含量，记为S1（%）。发酵处理前蟹壳质量M0（g），采用同样的方法进行处理，测灰分含量为S0（%）。脱钙率计算公式如下所示：

1.2.5 发酵条件优化

采用单因素试验，固定接种量为10%（种子培养基OD600值达4～5），分别考察发酵时间、葡萄糖浓度和固液比对脱钙率的影响，从而确定最优的发酵条件。发酵时间分别取1d、3d、5d和7d。葡萄糖浓度分别采用0g/100mL、2.5g/100mL、5g/100mL、10g/100mL和12.5g/100mL，除葡萄糖之外的条件同发酵培养基。选取固液比分别为5g/100mL、10g/100mL、20g/100mL和30g/100mL进行考察，即在发酵培养基基础上只改变蟹壳的添加量。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵蟹壳脱钙菌株的筛选

采用上述方法中菌株的筛选步骤，对15株乳酸菌进行了考察。所选15株乳酸菌均是根据以往报道常用的产乳酸的菌株，根据脱钙率的大小筛选出脱钙效果最好的菌株，结果如表2所示。

从表2中可以看出，所考察的15株乳酸菌中菌株AS 1.2437对蟹壳脱钙效果最好，发酵7d蟹壳脱钙率达到89.17%。因此，选用AS1.2437菌株进行后续研究。

2.2 发酵条件优化

表2 乳酸菌发酵蟹壳的脱钙率比较Table 2 Decalcification ratio of crab shell after fermentation with different lactic acid bacteria

乳酸菌发酵蟹壳脱钙的主要影响因素是发酵时间、糖浓度、接种量及发酵过程中的pH值，所以对AS 1.2437菌株进行了发酵时间、葡萄糖浓度和接种量这三个因素的考察，指标中除了测定发酵后的脱钙率，还对发酵过程中的pH值进行了分析。

2.2.1 发酵时间对乳酸菌AS1.2437处理蟹壳脱钙效果的影响

图1 发酵时间对蟹壳脱钙率及发酵液pH值的影响Fig.1 The effect of different fermentation time on pH and the decalcification ratio of crab shell

由图1，在发酵前3d，乳酸菌AS 1.2437随着发酵时间的延长，对蟹壳脱钙率显著提高，在发酵第3d，乳酸菌AS 1.2437对蟹壳脱钙率达到81%；发酵时间延长至第5d，乳酸菌AS 1.2437对蟹壳脱钙率相对发酵到第3d的脱钙率提高7.81%，此后随着发酵时间的延长乳酸菌AS 1.2437对蟹壳脱钙效果无显著性变化。通过对发酵过程中的pH进行监控，发现发酵前3d发酵液pH值显著降低；发酵第3d至第5d，发酵液pH值变化趋缓；发酵第5d后，发酵液pH值无显著变化。以上结果表明，蟹壳中碳酸钙的脱除主要受乳酸菌AS 1.2437在发酵过程中产生的酸性物质（如乳酸）的影响较大，而发酵时间对乳酸菌AS 1.2437在代谢过程中产生酸量多少有关。综合考虑到发酵成本、设备利用率与脱钙率等因素，后续研究中将发酵时间设定在5d。

2.2.2 发酵液中葡萄糖浓度对乳酸菌AS 1.2437处理蟹壳脱钙效果的影响

图2 糖浓度对蟹壳脱钙率及发酵液pH值的影响Fig.2 The effect of different glucose concentration on pH and the decalcification ratio of crab shell

菌体需要一定的碳源来生长繁殖，因此碳源浓度对于乳酸菌的生长及有机酸的产量有明显的影响。当葡萄糖作为乳酸菌生长的主要碳源时，乳酸菌通过同型乳酸发酵途径将葡萄糖转化为乳酸。葡萄糖浓度不足将导致乳酸菌可转化的碳源缺乏，限制了乳酸等有机酸的产生，从而会降低乳酸菌对蟹壳的脱钙效果；葡糖糖浓度过高，可能会对菌体生长代谢造成抑制效应，对菌体代谢产酸不利，同时会造成发酵成本的增加。由于，葡萄糖浓度对乳酸菌生长和有机酸产生密切相关。在本研究中，我们考察了发酵液中葡萄糖浓度对乳酸菌处理蟹壳脱钙效果的影响。由图2所示，在实验中所考察的发酵液中葡萄糖浓度范围，随着发酵液中葡萄糖浓度的提高，乳酸菌对蟹壳脱钙效果逐渐提高。当发酵液中初始葡萄糖达到10g/100mL时，乳酸菌对蟹壳脱钙率达到89.00%。

2.2.3 发酵液中蟹壳与发酵液的比例对乳酸菌AS1.2437处理蟹壳脱钙效果的影响

图3 固液比对蟹壳脱钙率及发酵液pH值的影响Fig.3 The effect of different solid-liquid ratio on pH and the decalcification ratio of crab shell

为保证发酵液能够充分润湿蟹壳，本实验采用的蟹壳与发酵液的比例最高为每100mL发酵液中含30g蟹壳。如图3所示，当发酵液中蟹壳与发酵液的比超过达到20g/100mL时，发酵液pH值呈碱性，表明乳酸菌产生的有机酸较少或被中和。当发酵液中蟹壳与发酵液的比小于10g/100mL时，发酵液pH值呈酸性。从脱钙率曲线上可以看出，蟹壳在发酵液中所占比例越小脱钙率越高，在固液比为5g/100mL时脱钙率高达95.5%。

3 结论与讨论

该研究以工业化应用为出发点，将15株乳酸菌为出发菌株，采用与蟹壳共发酵的方式进行了筛选，选出脱钙效果最好的编号为AS 1.2437的菌株。该菌株在接种量10%，固液比5g/100mL，糖浓度10g/100mL，发酵温度为30℃条件下发酵5d，脱钙率高达95.5%。植物乳杆菌AS 1.2437是发酵蟹壳脱钙的优良菌株。

在发酵条件优化实验中，在发酵时间0～7d、糖浓度0～12.5g/100mL和固液比5g/100mL～30g/100mL条件下，发酵时间越长、葡萄糖浓度越高、固液比越小脱钙效果越好。综合考虑葡萄糖浓度与固液比两个因素，葡萄糖质量与蟹壳质量比在2∶1时效果最好，脱钙率为95.5%；其比值为1∶1时脱钙率约为90%。理想条件下乳酸菌利用1mol葡萄糖产生2mol乳酸，而2mol的乳酸刚好与1mol碳酸钙反应生成1mol乳酸钙。在此理想条件下假设蟹壳中碳酸钙含量为50%，计算得乳酸与碳酸钙摩尔比为2.2∶1，与实际反应过程中二者的比例相近。因此利用乳酸菌发酵蟹壳脱钙，需要选择利用葡萄糖产乳酸效率高的菌株。

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