牛分支杆菌ag85b 基因的克隆及表达

马 玢，曾 瑾，李 武，刘晓明，邓光存＊

（1.宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川750021；2.宁夏大学生命科学学院，宁夏银川750021）

牛结核病（Bovine tuberculosis）是由牛分支杆菌（Mycobacterium bovis，MTB）引起的慢性人兽共患传染病。由于人类和牛的关系（牛肉，牛奶及奶制品等）较为密切，人可以通过与牛接触或食用牛肉、牛奶等制品而感染结核病。研究表明，约10%左右的人结核病是由牛分支杆菌所引起［1］。由此可见，该病的流行与传播不仅严重影响畜牧业健康稳定发展，而且威胁到人类的健康，被WHO列为必须报告的传染病。早在1960年，世界卫生组织（WHO）的专家就指出，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制不会成功。卡介苗（BCG）是预防结核病的惟一疫苗，但由于它的免疫保护效力不稳定，对人群的保护率介于0～80%之间［2］。而对于牛来讲，接种BCG后，会干扰牛结核菌素（PPD）的检测结果，导致人工免疫和自然感染不能区别，影响牛的检疫和国际贸易。因此，为控制牛结核病的传播流行，研制开发一种有效且高效的牛结核病新型疫苗迫在眉睫。

近年来，人们发现分支杆菌培养液中的分泌蛋白对于结核病的保护性免疫很重要，对结核病的预防和诊断具有重要的意义［3］。Ag85复合物是分支杆菌培养滤液中的主要分泌蛋白之一，包括Ag85A、Ag85B、Ag85C三种成分，其中Ag85B是机体的保护性抗原，具有高度的保护力。Ag85B可诱导特异性Th1型细胞免疫应答、诱导IFN－γ的产生及CTL反应。因此，它是开发新型抗结核药物作用的靶位点，也是开发新型疫苗的候选抗原。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 牛分支杆菌C68001株基因组DNA、BL21（DE3）菌株、质粒载体pET－28a（＋）由西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室保存；Trans1－T1Phage Resistant感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂 dNTPs、TransTaqTMDNA聚合酶，北京全式金生物技术有限公司产品；10×Ex Taq buffer、T4DNA Ligase、2×T4Buffer、NdeⅠ、HindⅢ，Fermentas公司产品；Wizard PCR preps DNA Purification System DNA凝胶回收与纯化试剂盒Promega公司产品；质粒小量提取试剂盒，天根公司产品；抗His标签小鼠单克隆抗体、HRP－羊抗鼠IgG，北京全式金生物技术有限公司产品；Western blot ECL，环亚生物公司产品。

1.2 方法

1.2.1 ag85b基因引物设计 根据GenBank报道的牛分支杆菌（AF2122／97）ag85b基因核酸序列及其His标签位置的考虑，设计了2条PCR引物，P1为 5′－CGCCATATGACAGACGTGAGCCGA－3′，P2 为 5′－CCCAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA－3′。引物中含有NdeⅠ和HindⅢ酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2 目的基因的PCR扩增 以牛分支杆菌C68001株基因组DNA为模板，扩增ag85b基因：即以P1、P2为引物，PCR反应条件为：94℃5min；94℃45s，62℃45s，72℃50s，共30个循环；72℃10min，4℃结束反应。取其扩增产物在10g／L的琼脂糖凝胶中电泳检查，并按 Wizard PCR preps DNA Purification SystemDNA凝胶回收与纯化试剂盒进行回收纯化。将扩增的目的基因与Trans1－T1载体连接后进行测序。

1.2.3 重组质粒的构建 以限制性核酸内切酶NdeⅠ和HindⅢ 分别对纯化的ag85b基因的扩增产物和质粒pET－28a（＋）进行双酶切，将双酶切得到的ag85b基因和质粒pET－28a（＋）DNA连接，转化到大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中，涂布于含有30μg／mL卡那霉素的LB培养平皿中，37℃培养过夜。

1.2.4 重组质粒的鉴定 从琼脂平板上挑取单个转化菌落，接种于10mL含有30μg／mL卡那霉素的LB液体培养基中，180r／min振荡过夜。利用小提质粒试剂盒提取质粒，分别进行PCR鉴定和NdeⅠ、HindⅢ 双酶切鉴定，在10g／L的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.5 Ag85B蛋白的诱导表达 将阳性重组菌株接种于10mL含有30μg／mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至A600值为0.5～0.7时，加入IPTG至终浓度1mmol／L，37℃诱导表达4h～5h，收集菌体。以同样的方法诱导空载体pET－28a作为对照。

1.2.6 重组表达产物的SDS－PAGE和免疫印迹（Western blot）分析 以空载体的转化菌为阴性对照，收集诱导表达后的菌体，冰浴超声破碎离心后，分别收集上清和包涵体沉淀，上样于180g／L聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS－PAGE分析，以确定Ag85B表达及其在大肠埃希菌中的表达形式。电泳结束后用半干电转法将凝胶上的蛋白转到硝酸纤维素膜上，经50g／L脱脂奶粉封闭1h，洗涤后再与1∶1 000倍稀释的抗His标签小鼠单克隆抗体在4℃条件下反应过夜，洗涤后再与1∶5 000的HRP－羊抗鼠IgG 37℃反应1h，充分洗涤后，用 Western blot ECL试剂盒化学发光曝光显影。

2 结果

2.1 ag85b基因的PCR扩增

将扩增产物以10g／L琼脂糖凝胶电泳，结果与预期扩增片段大小一致，大小为978bp（图1）。

将目的基因测序后与GenBank报道的牛分支杆菌（AF2122／97）ag85b基因的核酸序列进行比对，结果表明已成功克隆了ag85b基因。

2.2 重组质粒的鉴定

将构建的重组质粒pET28a－ag85b分别进行PCR鉴定和NdeⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，可见扩增的产物与预期大小相一致，大小为978bp（图2）。双酶切结果与预期一致，大小为978bp（图3）。

图1 ag85b基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR products of ag85b gene

图2 pET28a－ag85b质粒的PCR鉴定Fig.2 PCR analysis result of recombinant pET28a－ag85b plasmid

2.3 Ag85B重组蛋白的表达及鉴定

经IPTG诱导Ag85B，由SDS－PAGE结果分析为沉淀部分有明显的特异蛋白表达带，其分子质量为33ku；在大肠埃希菌BL21（DE3）中以包涵体形式存在（图4），Western blot鉴定结果表明，该蛋白能被His单克隆抗体特异识别，在约33ku处有1反应条带，对照组空载体pET28a无相应条带（图5），表明表达的蛋白为目的蛋白Ag85B。

图3 pET28a－ag85b质粒的双酶切鉴定Fig.3 Identification of recombinant pET28a－ag85b plasmid by restrictive enzyme digestion

图4 SDS－PAGE分析重组Ag85B在大肠埃希菌中的表达Fig.4 SDS－PAGE analysis of recombinant Ag85B expressed in E.coli BL21（DE3）

3 讨论

目前，国内外研究较多的结核分支杆菌免疫优势抗原蛋白主要有 Ag85复合物，CFP－10，ESAT－6，MPB64，MPB70和 MPB83等。抗原Ag85复合物是结核杆菌在生长过程中分泌到细胞外的，分子质量大小为30ku～32ku，是分支杆菌属共有蛋白。Ag85复合蛋白包括Ag85A、Ag85B和 Ag85C，其中Ag85A（也称P32、MPB44）为15%，Ag85B（也称a－Ag、MPB59）为22%，Ag85C为8%，该复合物属于分支杆菌酸转移酶，在分支杆菌细胞壁的合成及其结合纤连蛋白起着重要的作用［4］。其中，Ag85B是抗结核免疫中的主要保护性抗原，其抵抗结核分支杆菌再感染的能力优于BCG，是开发新型疫苗的理想候选抗原［5－8］。研究表明，Ag85B导致的细胞免疫反应最强，可诱导实验动物产生特异性Th1型细胞免疫应答，诱导IFN－γ的产生及CTL反应［9］。另外，Ag85B与其他抗原蛋白所融合的新型疫苗能显著地提高细胞免疫应答，抑制结核分支杆菌的生长，并有效地诱导特异性Th1型细胞免疫反应［10－14］。T－bet佐剂结合Ag85B的DNA疫苗与Ag85B单独的DNA疫苗或空载体相比，不仅能诱导机体以Th1型免疫反应为主，引起明显较高的IgG2a抗体反应，并增加 γ干扰素（IFN－γ）的产量［5，8］。Ballester M等［6］研究表明，用纳米材料聚丙烯硫化物包裹结核抗原蛋白Ag85B制成的纳米疫苗与佐剂CpG混合后，通过对小鼠肺部给药的方式发现可以增强在脾脏的Th1型免疫反应的诱导作用。Van Dissel J T等［7］研究表明，由 Ag85B－ESAT－6融合蛋白与IC31佐剂相结合制成的新型疫苗可以增强T细胞的抗原特异性反应，并能持久的诱导免疫反应。融合蛋白Ag85B－Esat6－HspX的DNA疫苗能够显著提高IFN－γ和IL－2的表达水平，并能有效的诱导Th1型细胞免疫应答［15］。以上研究提示，Ag85B是结核病新型疫苗研究的理想抗原之一。

图5 Ag85B蛋白Western blot结果Fig.5 Western blot analysis of recombinant Ag85Bproteins

本研究克隆了免疫优势抗原基因ag85b，构建了重组基因工程菌株并进行了诱导表达，表达的蛋白经过Western blot分析证实能被特异性抗体识别，为下一步研制牛结核病新型疫苗及诊断制剂奠定了基础。

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