猪流行性腹泻病毒HB／FN株S基因的克隆、原核表达及免疫原性分析

王晨枫，左玉柱，裴丽华，杨 震，范京惠

（河北农业大学动物科技学院，河北保定071001）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）［1］引起的以严重腹泻和仔猪高致死率为主要特征的传染病。该病首次报道于英国，随后许多国家相继报道［2］，我国于1976年发现此病［3］。目前该病已成为中国甚至亚洲最常见的猪腹泻性传染病之一［4］。因此，PED的防控研究具有重要的意义。PED呈地方流行性，PEDV在流行的过程中为更好地适应环境，会发生变异，不同地区的毒株有显著差异，地区相距越远、环境差异越大的地方毒株差异越大。研究发现，S基因相比较于其他基因更易发生变异［5－8］，S蛋白是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白［9－10］，具有高度免疫原性，此外，感染PEDV猪血清中的抗S蛋白抗体持久，可在长时间中检测到S蛋白的抗体。这些特性使其成为猪流行性腹泻的主要早期诊断蛋白。本研究对PEDV S基因抗原性较高的片段进行克隆并测序，利用大肠埃希菌表达系统对重组S蛋白进行表达和纯化，为建立PEDV的快速、敏感、特异的免疫学检测方法提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与实验动物 猪流行性腹泻病毒华北抚宁株（HB／FN）由河北农业大学兽医微生物实验室保存；6周龄～8周龄SPF级Balb／c小鼠购于北京东大实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 Trizol为GIBCO公司产品；MMLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、pMD19－T载体、250bp DNA Marker、DNA Marker DL 5 000等为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA胶回收试剂盒、小量质粒纯化试剂盒、HRP标记的羊抗兔IgG羊及抗鼠IgG为CWBIO公司产品；E.coli DH5α感受态细胞和蛋白Marker为TransGen公司产品；蛋白纯化试剂盒B－PER（r）6×His Spin Purification kit为PIERCE公司产品；TMB、完全弗氏佐剂（FCA）和不完全弗氏佐剂（FCIA）为SIGMA公司产品；pET－28a（＋）载体、pET－32a（＋）载体、pGEX－6p－1载体、Vero细胞、E.coli BL21（DE3）以及兔抗PEDV的阳性血清由河北农业大学兽医微生物实验室制备。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 参照GenBank中发表的PEDV中国LZC株S基因序列（登录号EF185992.1），并且根据pMD 19－T 克隆载体的特点，用Primer5.0软件设计了一对引物，在上游引物引入BamHⅠ酶切位点，下游引入XhoⅠ酶切位点，预期扩增产物大小为1 080bp。引物序列为：SP1：5′－ATGTATTCTGTTACGCCATG－3′；SP2：5′－TTATACGGTAAGTTGGGTCA－3′。

1.2.2 S基因的克隆与序列测定 猪流行性腹泻病毒HB／FN株于Vero细胞上培养72h，反复冻融3次。取250μL病毒培养液，加入750μL Trizol抽提RNA并进行反转录，得到的产物进行PCR扩增。将PCR产物与pMD19－T经T4连接酶连接，转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑取白色菌落，接种于氨苄LB培养基中，37℃培养12h后用小量质粒提取试剂盒提取质粒，对该质粒进行PCR及酶切鉴定和测序。

1.2.3 优势抗原表位的选取和重组表达载体的构建 测序结束后，将基因序列登陆于GenBank。对扩增片段进行抗原性分析，选取抗原性较高的一段设计对应的引物：SP1（Bam2145）5′－GGATCCATGGTTATTTCTAGTTTG －3；SP2（Xol2800）5′－CTCGAGTTAGACTAGATCTGCCA－3，扩增得到一段655bp的基因序列，同样连到pMD19－T载体上，命名为SFN－T。分别将SFN－T和表达载体用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后回收带有相互匹配黏性末端的SFN和表达载体，经T4DNA连接酶连接，构建出重组表达载体pET－28a（＋）－SFN、pET－32a（＋）－SFN、pGEX－6p－1－SFN。将表达载体转化Rosetta（DE3）感受态细胞后，用小量质粒提取试剂盒提取质粒并进行电泳检测和酶切鉴定。

1.2.4 PEDV S基因的表达及表达产物的SDSPAGE分析 将表达载体空载体菌种分别接于LB培养基中，200r／min振摇培养12h，取500μL菌液转接于50mL LB培养基中，37℃振摇培养至对数生长期（OD 600nm值＝0.6～1.0），加入终浓度为1 mmol／L的IPTG，在20℃振摇诱导培养，分别于诱导后0、2、3、4、5h取样1mL，12 000r／min离心1 min，弃上清。沉淀用50μL PBS重悬后，加入等体积的上样缓冲液，变性仪变性5min，12 000r／min离心1min取上清进行SDS－PAGE电泳。

1.2.5 重组蛋白的纯化及 Western blot分析 将在28℃条件下用终浓度为1mmoL IPTG诱导5h后的菌体离心，PBS重悬后进行超声波裂解，分别收集上清沉淀进行SDS－PAGE检测。按PIERCE公司的B－PER（r）6×His spin purification kit蛋白纯化试剂盒的纯化程序对菌体蛋白进行纯化。将纯化的蛋白进行SDS－PAGE电泳，采用湿转法将蛋白及Marker转印到NC膜，将NC膜放入封闭液中37℃慢摇封闭1h，用PBST洗膜3次，每次10min；加入为1∶100的兔抗PEDV的阳性血清。室温下轻摇1h，用PBST洗膜3次，每次10min；然后加1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，室温下轻摇1 h，再用PBST洗涤2次，每次10min；最后置于DAB显色液中避光显色15min后用蒸馏水终止反应。

1.2.6 ELISA检测方法的建立 取PEDV HB／FN毒株在Vero细胞上的培养72h的培养液反复冻融3次后，8 000r／min离心15min后沉淀，上清液以20 000r／min超速离心2h，把上清液浓缩，测定蛋白浓度后分装。按常规ELISA程序进行试验确定最适工作条件。

1.2.7 纯化蛋白的免疫原性分析 纯化的S蛋白经SDS－PAGE和Western blot分析后，使用超微量紫外分光光度计（Micro－Spectrophotometer）测定蛋白浓度。将纯化的S蛋白分别用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按1∶1比例混合乳化，接种6周龄～8周龄SPF级Balb／c小鼠5只，并设对照组。分别于免疫前、首免后7d、14d、21d和30d时测定小鼠抗体水平以确定纯化蛋白的免疫原性。

接种程序：弗氏完全佐剂首免，以后每隔7d用弗氏不完全佐剂免疫小鼠。

2 结果

2.1 PEDV S基因的PCR扩增及鉴定

以加入限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的SP1／SP2为引物，进行PCR扩增，得到的DNA于10mg／L琼脂糖凝胶中电泳观察结果，在约1 000 bp处出现一条特异的DNA带，与预期扩增的S基因大小相符。将此片段用试剂盒回收，回收产物连入pMD19－T，构建重组质粒。参照pMD19－T载体图谱，用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒进行进行双酶切，出现一条1 080bp左右的目的片段和一条2 692bp左右的pMD19－T载体片段，与预期结果相符（图1）。将阳性重组质粒进行序列测序，测序结果表明，扩增基因片段长1 080bp，与GenBank参考株的PEDV S基因进行Blast序列比对，同源性一致。将克隆得到的S基因登陆于Gen－Bank，获得序列号JQ862712。

2.2 S基因优势抗原表位基因克隆载体的建立与鉴定

对S基因进行抗原性分析，选取抗原性较高的655bp基因作为连入表达载体的目的基因，同样连到pMD19－T载体上，命名为SFN－T。用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒进行进行双酶切，出现一条约655bp的目的条带和一条约2 692bp的pMD19－T载体片段，与预期结果相符（图2）。

图1 重组质粒的双酶切鉴定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid by double enzyme digestion

图2 重组质粒SFN－T的双酶切鉴定Fig.2 Identification of the plasmid SFN－T by double enzyme digestion

2.3 重组表达载体的构建及表达

用BamHⅠ、XhoⅠ对重组质粒pET－28a（＋）－SFN进行双酶切及PCR鉴定（图3），分别出现一条5 000bp和650bp左右的条带，说明目的基因正确插入到表达载体。将含有阳性重组载体的大肠埃希菌在IPTG诱导下，不同诱导时间的产物经SDSPAGE检测，结果在约25ku处可见表达条带，与预期蛋白大小相一致（图4），而未诱导菌和空载体菌均没有出现此蛋白条带，与诱导前对照菌相比，诱导5h时表达量最高。

图3 重组质粒pET－28a（＋）－SFN的双酶切鉴定Fig.3 Identification of the plasmid pET－28a（＋）－SFN by double enzyme digestion

图4 诱导不同时间重组菌的SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE of the expressed recombinant protein induced in different time

2.4 纯化S蛋白的Western blot检测

收集诱导5h后的菌体沉淀进行超声波裂解，对裂解上清和裂解沉淀进行SDS－PAGE分析可知蛋白是以包涵体形式进行表达。对裂解沉淀进行处理后用His标签纯化试剂盒对菌体裂解蛋白进行对纯化。SDS－PAGE分析可知纯化效果较好，洗脱峰1和2蛋白量较大（图5）。用兔抗PEDV的阳性血清作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，对洗脱峰2进行Western blot检测。结果显示，在一抗为1∶100和二抗为1∶1 000时pet－28a（＋）－SFN阳性菌表达产物就可出现大小约25ku的特异性反应条带（图6），表明重组蛋白可被PEDV阳性免疫血清识别。

2.5 ELISA检测方法

经过多次试验分析，最终确定了ELISA检测方法的条件：HB／FN病毒抗原经4℃包被过夜，洗涤；用封闭液（含50mL／L犊牛血清的PBST）37℃封闭1h；加入用封闭液进行1∶100倍稀释的待检血清100μL，于37℃反应1h，洗涤；加入用封闭液进行1∶1 000倍稀释的二抗100μL，于37℃反应45 min，洗涤；加入100μLTMB显色液避光显色15 min；加入终止液50μL后测定OD450nm值。

2.6 重组蛋白的免疫原性分析

纯化的S蛋白用SDS－PAGE和 Western blot分析后用超微量紫外分光光度计测蛋白浓度，重复5次。分别为0.409，0.413，0.391，0.399，0.402 mg／mL，取其平均值约为0.4mg／mL。将纯化的S蛋白分别用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按1∶1比例混合乳化，接种6周龄～8周龄SPF级Balb／c小鼠5只，每只250μL，对照组不接种。分别于免疫前、首免后7、14、21d时尾静脉采血，检测小鼠抗体（表1）。在第14天时小鼠的抗体水平明显超过对照组，在免疫后21d血清OD450nm值达到1.0以上。

图5 S蛋白纯化的SDS－PAGE分析Fig.5 SDS－PAGE analysis of S protein purification

表1 抗体效价的ELISA检测结果均值（OD450nm）Table 1 Average results of antibody titers detected by ELISA（OD450nm）

图6 纯化S蛋白的Western blot检测Fig.6 Western blot detection of purified S protein

3 讨论

近年来，各类病毒引起的仔猪腹泻极为流行，严重影响仔猪的生长发育，给养猪业带来巨大的经济损失。中国农科院哈尔滨兽医研究所对猪的几种腹泻病进行RT－PCR检测的结果显示［6］，我国的养猪业因病毒感染而导致腹泻的主要病毒中，PEDV占46%，猪轮状病毒（Porcine rotavirus，PRV）占8%，猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）占15%，可见PEDV俨然成为当前国内猪群腹泻流行的最主要原因。PEDV感染无特效治疗药物，且PED与其他腹泻类疾病在临床上区别难度大。研究发现，PEDV最早排毒出现在感染后2d到6d，在症状出现前即排毒，临床症状消失后很长一段时间仍可在其粪便中要检出［11］。因而，建立新型科学便捷的检测方法可有效防止病毒传染。

病毒可以作为抗原包被ELISA板建立检测方法，但PEDV细胞培养病毒难度大，病毒产量低，一定程度限制了检测抗原的大量制备［12－13］，使得细胞毒临床应用价值低，仅局限于实验室检测。目前，检测PEDV抗体的主要诊断技术有病毒中和试验（VN）、免疫荧光抗体试验（IFA）和ELISA 等［1］，但缺点是耗时和昂贵，胶体金试纸条作为新兴的检测方法，具有快速准确方便等特点，符合基层的需要。河北农业大学兽医微生物实验室已经得到了华北地区的7段M基因［14］，5段S基因，全部登陆于Gen－Bank。国内其他实验室的PEDV M蛋白的单抗制备也在进行中［15］。由于S基因全长4 152bp，编码1 383个氨基酸残基，完整的S基因扩增和表达难度大，所以国内外的抗原研究集中在M蛋白上，对于S蛋白和N蛋白等的研究还很少。S蛋白是暴露于病毒表面的纤突蛋白，且产生的抗体水平持续时间比M蛋白要长，用S蛋白作为检测抗原更可靠。

综上所述，对从PEDV HB／FN株中扩增得到的S基因片段进行克隆，选取其中一段抗原性较高的片 段，构 建 pET－28a（＋）－SFN、pET－32a（＋）－SFN、pGEX－6p－1－SFN 3种表达系统。作为原核表达体系的优化，表达的温度和IPTG的浓度对表达水平影响也很大。一般在15℃～42℃之间都能获得成功表达，但表达每一种特定蛋白质的最适温度范围则可能很窄，只有2℃～4℃的范围［16］。经分析，这3种表达载体在IPTG终浓度为1mmol／L，28℃诱导后都出现了对应的目的条带。表达载体pET－28a（＋）－SFN表达的S蛋白量大，且分子质量小，仅为25ku。利用pET－28a（＋）载体带有特异的6×His标签，对重组蛋白进行纯化得到了0.4 mg／mL的S蛋白。Western blot分析可看出纯化的S蛋白可以与兔免疫PEDV血清反应。将纯化的S蛋白免疫小鼠，小鼠抗体水平在免疫后14d抗体水平明显高于对照组，试验说明纯化的S蛋白具有很好的免疫原性，可用作免疫蛋白进行后续研究。利用亲和层析纯化带有6×His的重组S蛋白，可以作为一种新型制备PEDV检测抗原的方法。将制备基于S蛋白的PEDV免疫胶体金检测试纸条，从而快速检测PEDV抗体，用于猪流行性腹泻病毒的早期检测。

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