HPLC法测定不同产地金荞麦超微粉（-）-表儿茶素含量

王 航，王洪鸽，卢亚艺，唐 棣，吉莉莉，汤 承＊

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；2.四川省兽药监察所，四川成都610041）

金荞麦为蓼科植物金荞麦（Fagopyrum dibotrys）的干燥根茎，味微辛、涩，性凉，具有清热解毒、排脓祛瘀之功效，临床用于治疗肺脓肿、麻疹肺炎、扁桃体周围脓肿［1］。其有效成分为原花色素类缩合鞣质及其前体的混合物，包括（-）- 表儿茶素［（-）-epicatechin］及其衍生物的单体、二聚体和多聚体［2］。金荞麦乙醇提取物为一类含原花色素的缩合性单宁混合物，主要由（-）-表儿茶素及其二聚体组成，其中（-）- 表儿茶素单元的质量分数占65% ～70%［3］。金荞麦醇提物对猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌有较强的抑菌效果，而对副猪嗜血杆菌、多杀性巴杆菌、大肠埃希菌的抑菌效果相对较弱［4-9］。金荞麦醇提物可明显抑制C57／BL6小鼠Lewis肺癌生长［10］，有促进白细胞上升，保护粒细胞的作用［8］；金荞麦醇提物也可以对鸡脾淋巴细胞的增殖活性呈明显的时效及量效关系［11］。何美珊等［12］对不同产地金荞麦饮片醇提物中（-）-表儿茶素含量进行测定，表明金荞麦根具有免疫调节活性。但还未见不同产地金荞麦超微粉醇提物中（-）-表儿茶素的含量进行测定的报道，本研究旨在了解我国不同产地金荞麦中（-）-表儿茶素含量是否存在差异，为金荞麦相关制剂的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 LC-10AT 型高效液相色谱仪日本岛津公司产品，CPA2250 型电子天平，德国Sartorius公司产品，WK-150 型小型超微粉碎机，RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品，SH13-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司产品。

1.1.2 试剂 乙腈、乙醇、磷酸均为分析纯；（-）-表儿茶素对照品，成都瑞芬思生物科技有限公司产品，批号B-020-111023，HPLC≥98%。

金荞麦8个金荞麦饮片待检样本分别来自四川（批号120510）、内蒙古（批号120909）、云南（批号120920）、贵州（批号120602）、江苏（批号120703）、江西（批号120512）、浙江（批号120701）、安徽（批号120601）。

1.2 方法

1.2.1 金荞麦超微粉的制备 将各产地金荞麦饮片通过小型超微粉碎机粉碎，过400目筛，制成粒径在0.75nm 以下的超微粉。

1.2.2 （-）-表儿茶素的提取 （-）-表儿茶素的提取参考文献［12-15］提取金荞麦超微粉中的（-）-表儿茶素的方法。分别精确称取不同产地的金荞麦超微粉各2.5g于具塞锥形瓶中，准确加入500mL／L乙醇50mL，密封，称定总重量，随后超声波处理30 min，室温过夜，加热回流1h，用500 mL／L乙醇补足损失重量，摇匀，四层纱布滤过。精密吸取滤液25mL，减压浓缩至完全干燥，残渣加入10mL乙腈-水（1∶9）分次洗涤，并移至10mL量瓶中，10 000r／min离心5min，取上清液5mL备用。

1.2.3 高效液相色谱测定表儿茶素的含量 色谱条件色谱条件与系统适用性试验参考文献［12］，色谱柱为Kromasil C 柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流动相为水（用磷酸调pH 至3.00±0.02）-乙腈（92∶8），流量为1.0mL／min，柱温为35℃，检测波长为278nm，进样量为10μL。

1.2.4 对照品溶液的制备 精密称取（-）-表儿茶素对照品3.52 mg，加入乙腈-水（1∶9）制成含（-）-表儿茶素35.2μg／mL的溶液。

1.2.5 线性关系测定 用乙腈-水（1∶9）将取1.2.4中的对照品溶液2 倍稀释成0.55μg／mL～1.76μg／mL的对照品溶液。以（-）-表儿茶素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.6 重复性试验 取产地为四川的金荞麦超微粉6份，每份2.5g，按1.2.2方法提取，按1.2.3色谱条件测定。计算（-）-表儿茶素含量。

1.2.7 精密度测定试验 取质量浓度为1.76 μg／mL的（-）-表儿茶素对照品溶液重复进样6次，按1.2.3色谱条件测定，计算平均峰面积。

1.2.8 回收率试验方法 采用加样回收法，取已知含量的金养麦超微粉（产地四川）6份，每份1.25g，分别精密加入6.0μg／mL（-）-表儿茶素对照品溶液1mL。按1.2.2 方法提取（-）-表儿茶素，按1.2.3色谱条件测定，计算其峰面积。

2 结果

2.1 线性关系测定结果

回归方程为Y＝519 812.36X＋2 018.12，r＝0.999 2（n＝5），X表示（-）-表儿茶素质量浓度（μg／mL），Y为峰面 积，（-）-表儿茶素在0.55 μg／mL～17.6μg／mL 与峰面积线性关系良好。标准品与供试品样品的色谱图见图1。图中x轴表示出峰时间，y轴表示电信号响应值（mv）。

图1 （-）-表儿茶素HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of（-）-epicatechin

2.2 精密度测定结果

测得（-）- 表儿茶素峰面积平均值为913 360.3mAU＊s，RSD 为0.74%。表明仪器精密度良好。

2.3 重复性试验结果

（-）-表儿茶素含量平均值为7.419 8μg／g，RSD 为1.70%，表明该方法重复性好。

2.4 回收率试验结果

结果表明（-）-表儿茶素平均回收率93.86%，RSD 为3.10%。表明此方法检测（-）-表儿茶素含量可靠、稳定。

2.5 样品含量测定

8个产地金麦超微粉（-）-表儿茶素含量结果见表1。

表1 金荞麦超微粉中（-）-表儿茶素含量（μg／g，n＝3）Table 1 Determination of（-）-epicatechin in Fagopyrum dibotrys（μg／g，n＝3）

3 讨论

中药材在长期特定的气候条件和土壤条件等环境中生长，其有效成分含量也大不相同，本试验最终样品含量结果表明不同产地金荞麦中（-）-表儿茶素含量确有不同，（-）-表儿茶素含量也受到不同产地等因素的影响。

本试验中所得到到金荞麦超微粉醇提物中的（-）-表儿茶素含量在6.45μg／g～8.81μg／g之间，低于金荞麦饮片醇提物中所检测到的含量［12］。分析其原因有以下几点：一是因（-）-表儿茶素对温度敏感，在金荞麦超微粉的制备过程中温度升高，极易使（-）-表儿茶素氧化分解［16］。二是制备超微粉过程中因超微粉粒径过小，与空气接触面积变大，使有效成分极易与空气接触导致氧化［17］。

目前，金荞麦和其他大部分中药饮片在生产、流通、使用中很难准确分析、定量其中的有效成分，严重影响了中医临床用药的安全、有效。现代高效液相色谱技术能快速、准确的检测微量物质的含量，为中药成分的鉴别、定量提供快速、准确的检测手段。为以（-）-表儿茶素含量的多少来制定金荞麦超微粉的质量控制标准提供了科学依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2005：69，89，109，52。附录31，附录32.

［2］邵 萌，杨跃辉，高慧媛.金荞麦的化学成分研究［J］.沈阳药科大学学报，2005，22（2）：100-102.

［3］Yao R C.Activity constituents of antitumor fromFagapyrum cymosum［J］.Acta Bot Yunnan，1989，11（2）：215-218

［4］周玉岩，乔红杰.金荞麦提取物体外抗菌活性研究［J］.中兽医医药杂志，2009（5）：44-46.

［5］包 鹏，张向荣，周晓棉，等.金荞麦提取物的药效学研究［J］.中国现代中药，2009，11（7）：36-37.

［6］盛华刚，朱立俏，林桂涛.金荞麦的化学成分与药理作用研究进展［J］.西北药学杂志，2011，4（2）：26-29.

［7］汪春彦，吴常青，江 勤，等.金荞麦对克雷伯杆菌肺炎大鼠心肌损伤中炎症细胞因子表达的影响［J］.安徽医科大学学报，2011，46（1）：44-48.

［8］张永仙，王 权.金荞麦有效成分的抗菌抗感染作用［J］.云南畜牧兽医，1996（2）：22.

［9］程友斌，潘洪林.金荞麦抗炎活性部位筛选研究［J］.时珍国医国药，2009，20（9）：2219-2220.

［10］陈晓锋，顾振纶，杨海华，等.金荞麦Fr4对小鼠lewis肺癌细胞MMP-9、TIMP-1蛋白表达的影响［J］.苏州大学学报：医学版，2005，25（3）：383.

［11］乔红杰，王贵平，李春玲.金荞麦根提取物对鸡脾淋巴细胞活性影响的血清药理学研究［J］.动物医学进展，2010，31（3）：44-48.

［12］何美珊，钱炳辉.HPLC 法测定金荞麦中（-）-表儿茶素含量［J］.中草药，2005（3）：36.

［13］陈 煦.HPLC法测定金荞麦片中原儿茶酸和表儿茶素的含量［J］.药物分析杂志，2010，30（4）：641-643

［14］Song R，Cheng Y，Tian Y.A validated solid-phase extraction HPLC method for the simultaneous determination of gallic acid，catechin and epicatechin in rhubarb decoction［J］.Chinese J Natural Med，2012，10（4）：275-278.

［15］潘金火，严国俊，卢 欢.反相HPLC测定金荞麦药材和饮片中表儿茶素的含量［J］.中国药学杂志，2010，45（14）：1092-1094.

［16］杨 莉，丁安伟，张 丽，等.正交试验法优选金养麦的提取工艺［J］.中国药业，2009，18（1）：32-33.

［17］栾 梅，吕敬慈.金荞麦超临界CO2流体的萃取工艺［J］.上海大学学报，2008，14（3）：328-330.