禽呼肠病毒S1733株σNS 单克隆抗体的制备及其特性鉴定

谢志勤，谢芝勋，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢丽基，范 晴，罗思思

（广西壮族自治区兽医研究所 广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001）

鸡关节炎是由禽呼肠病毒（Avian reovirus，ARV）引起的危害商品雏鸡的一种病毒病，随着养鸡业的发展，该病的发生也越来越来常见。由禽呼肠病毒引起的临床症状主要为雏鸡关节炎、腱鞘炎，严重时出现鸡关节肿大，站立不稳，从而导致吸收障碍，抵抗力下降，很容易继发其他病原的感染而导致死亡，造成很大的经济损失［1］。

禽呼肠病毒是双股RNA病毒，属于呼肠病毒科、呼肠病毒属，其基因组由大（L）、中（M）和小（S）三组基因组成，分为10个节段，σNS基因属于S基因组中S4基因，其编码的蛋白是一种较小的非结构蛋白，具有单股RNA（ssRNA）结合活性，目前已知的σNS蛋白功能与病毒中mRNA有关，并且与基因组的复制有关［2－4］。

目前，对禽呼肠病毒的检测已建立了很多方法，主要有病毒中和试验、琼脂扩散试验、ELISA［5］、RT－PCR［6］和荧光定量 RT－PCR［7－9］等，基于单克隆抗体（mAb）建立的免疫检测技术，具有特异性强和敏感度高的优点，在疾病诊断方面已得到了广泛的应用。目前，未见有针对ARVσNS的单克隆抗体，本研究利用σNS蛋白筛选出抗ARVσNS蛋白的特异性单克隆抗体，并对其生物学特性进行鉴定，为建立一种敏感、特异、快速、简便的ARV临床检测方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 ARV S1733毒株，由美国康州大学Khan博士惠赠；骨髓瘤细胞SP2／0由美国宾夕法尼亚州州立大学动物诊断中心刘教授惠赠；ARV R1、ARV R 2以及鸡新城疫病毒（LaSota，NDV）、H9亚型禽流感病毒（AIV H9）、鸡传染性支气管炎病毒M41（IBV M41）、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）由广西畜禽疫苗新技术重点实验室保存。

1.1.2 鸡胚和实验动物 SPF种蛋购自北京梅里亚公司，经本实验室于37℃严格无菌孵化，供病毒增殖用；Balb／c小鼠，购自广西医科大学实验动物中心。

1.1.3 主要酶与剂试 预染低分子质量蛋白MarkerⅢ，购自天根生物公司；弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，胎牛血清，1640改良培养基，细胞融合剂（PEG－4000），HRP／FITC 标 记的 羊 抗 鼠IgG，BCIP／NBT，HAT，HT选择培养基，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，TEMED，Tris碱和过硫酸铵，均购自Sigma公司；其他试剂为分析纯国产试剂。

1.2 方法

1.2.1 抗原的增殖 将ARV S1733毒株用灭菌的PBS溶液进行100倍稀释后，卵黄囊腔接种8日龄的SPF鸡胚0.2mL，37℃培养，弃去24h内的死胚，收获24h～96h内死胚的尿囊液和尿囊膜。尿囊膜用灭菌研钵进行研磨，然后与尿囊液混合，在－70℃冻融3次，直接用于病毒的纯化或置－70℃保存备用。

1.2.2 抗原的浓缩与纯化 将收获的病毒液以8 000r／min离心15min，收集上清液用病毒浓缩仪和浓缩过滤器（Master Flex console driver，7520－47，美国Thermo Fisher Scientific产品）进行1／5浓缩；经浓缩的病毒液用250g／L～700g／L的蔗糖进行密度梯度离心纯化，40 000r／min离心4h，收集病毒，用PBST溶液洗涤，20 000r／min离心2h，收集沉淀即为纯化的病毒，用SDS－PAGE分析并用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所，产品编号：P0012）测定病毒浓度。

1.2.3 免疫Balb／c小鼠 取健康6周龄Balb／c小鼠3只，将纯化的病毒测定浓度后，按首免注射100 μg的剂量与等体积弗氏完全佐剂乳化，二免、三免各注射100μg的剂量与等体积弗氏不完全佐剂乳化，腹腔注射免疫Balb／c小鼠，四、五次免疫不用佐剂，各免注射100μg的剂量。首次与二次免疫间隔20d，三、四、五次免疫间隔3d～7d不等，五次免疫3d后尾静脉采血，测定静脉血中的抗体效价，选效价高的小鼠进行细胞融合试验。

1.2.4 间接ELISA筛选方法的建立 将纯化的ARV按一定的浓度包被ELISA板，包被液为4℃保存的0.05mol／L 碳酸缓冲液（pH9.6），然后用小鼠制作的ARV阳性血清进行系列稀释后作为一抗，浓度从1∶100倍比稀释到1∶6 400，加到ARV包被的ELISA板进行方阵试验，以确定最佳的抗原包被浓度以及抗体稀释度浓度，确定阴阳性临界值，以阳性血清和抗原的OD值最接近于1.0时的最大稀释浓度作为抗原抗体的最适工作浓度，建立间接ELISA检测方法。

1.2.5 融合细胞的筛选和单克隆抗体的制备 细胞融合、腹水制备、单克隆抗体的纯化按常规方法［10］进行。利用已建立好的间接ELISA方法进行筛选。

1.2.6 单克隆抗体效价的测定及鉴定 利用已建立的间接ELISA方法检测小鼠腹水效价；对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体（细胞上清液）用Southern－Biotech公司出产的SBA ClonotypingTM System／HRP单克隆抗体分型试剂盒进行鉴定，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.7 单克隆抗体特异性鉴定

1.2.7.1 Western blot检测 采用变性还原SDSPAGE，浓缩胶配制为60g／L，分离胶配制为120 g／L，σNS蛋白上样量每孔为20μL含30mg／mL，与上样溴酚蓝混合，沸水中煮5min，60V电压至分离胶与浓缩胶交汇处，然后改用120V电压至溴酚蓝到达底部。用Invitrogen公司生产的电转移仪iBlot（型号：10048044）及转移试剂盒 （iBlot Gel Transfer Stacks PVDF，Regular，型号：IB4010－01）将病毒蛋白转移到硝酸纤维膜上，用50g／L的脱脂奶固定1h，用PBST溶液洗膜3次，用制备的单抗腹水按1∶200稀释后加到硝酸纤维膜上，37℃作用1h后，用PBST溶液洗膜3次，加入磷酸酶标志的羊抗鼠二抗，37℃作用1h后，用PBST溶液洗膜3次，加入BCIP／NBT进行显色10min。

1.2.7.2 Dot－ELISA 检测 将纯化的σNS蛋白、ARV S1733、ARV R1和ARV R2以及NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV各10μL分别点在NC膜上，在超净工作台干燥后加入50g／L的脱脂奶粉于37℃封闭1h，PBS洗涤后分别加入经稀释的单克隆抗体及SP2／0骨髓瘤细胞培养上清，37℃作用1h后，加入磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃作用1h后，用PBS液洗涤3次，每次5min，然后加入显色液进行显色，观察结果。

1.2.7.3 直接免疫荧光（DFA）法检测 用9日龄的SPF鸡胚制备鸡胚成纤维细胞，细胞在24孔板中长成单层后，用ARV S1733毒株感染鸡胚成纤维细胞，37℃培养30h后，在显微镜下观察有细胞病变出现，用丙酮和乙醇进行固定30min，比例为3∶2，吸出固定液，然后分别加入用FITC标记的σNS蛋白单克隆抗体及SP2／0骨髓瘤细胞培养上清，37℃作用1h，用PBS溶液洗涤3次后，荧光显微镜下观察结果。

1.2.7.4 病毒中和试验 参照文献［11］的方法测定ARV的EID50，采用固定病毒的方法，将单克隆抗体倍比稀释后与相同体积的200EID50／0.2mL的ARV S1733毒株充分混匀，同时设ARV S1733阳性和阴性对照，37℃作用1h，然后接种于生长良好的96孔细胞板单层的成纤维细胞中，于体积分数为5%的CO2培养箱中37℃培养48h。用直接免疫荧光（FA）的方法进行病毒中和检测，记录细胞的病变和荧光情况。

2 结果

2.1 抗原的浓缩与纯化

利用病毒浓缩仪和浓缩过滤器收集的病毒，再经过蔗糖密度梯度离心获得的纯化病毒，经测定浓度为40.5mg／mL。

2.2 间接ELISA筛选方法的建立

将纯化的ARV测定其浓度后包被酶标板，加入一抗和二抗后经方阵试验，确定最佳的σNS蛋白抗原工作浓度为25μg／mL，抗体稀释度浓度为1∶800，封闭液为10g／L的BSA，37℃孵育1h；酶标二抗稀释度为1∶1 000，37℃孵育1h；洗液为含0.5mL／L吐温－20的PBS。

2.3 杂交瘤细胞分泌抗体的测定

应用建立的σNS蛋白ELISA检测方法对杂交瘤细胞分泌的抗体进行测定，初步判为阳性的有3孔，再次筛选阳性为1个孔，然后进行3次亚克隆，最后获得1株能稳定分泌抗ARVσNS蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株，命名为SB2－1K3。扩大培养获得的细胞株，离心收集细胞后注入Balb／c小鼠腹腔并制备出腹水，经测定效价为1∶10 000以上。

2.4 单克隆抗体亚类的鉴定

用SBA ClonotypingTM System／HRP单抗分型系统对制备的1株分泌单克隆抗体进行鉴定，鉴定结果为IgG 1亚类单克隆抗体，其轻链均为κ链（表1）。

表1 细胞上清反应性与单克隆抗体亚类的鉴定结果Table 1 The results of reactivity of hybridoma supernatant and isotype of monoclonal antibodies

2.5 Western blot检测

纯化的σNS蛋白经SDS－PAGE变性电泳，考马斯亮蓝染色后出现了2条分别约为66ku和27 ku的蛋白带，经Western blot后，ReoS1733和分离株R1只出现约为66ku的蛋白带（图1）。

图1 单抗Western blot检测结果Fig.1 The detection results of monoclonal antibody by Western blot

2.6 Dot－ELISA检测

将σNS蛋白、ARV S1733、ARV R1和ARV R 2以及对照的病毒液各10μL分别点在NC膜上进行Dot－ELISA试验，以阳性鼠血清作为阳性对照，SP2／0骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照。2株MAb SF6－3K3和SB2－1K3只与未经变性处理的ARV毒株发生特异性反应，出现棕色的反应斑，与NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV 等对照株均无交叉反应，骨髓瘤细胞培养上清也没有出现反应斑，证明1株单克隆抗体有良好的特异性（图2和表2）。

图2 Dot－ELISA检测单克隆SB2－1的特异性结果Fig.2 The specific test results of monoclonal antibody SB2－1by dot－ELISA

表2 单克隆抗体SB2－1K3的Dot－ELISA特异性鉴定结果Table 2 Specificity identification of monoclonal antibody SB2－1K3by Dot－ELISA

2.7 直接免疫荧光（DFA）法检测

将ARV S1733感染鸡胚成纤维细胞后，用丙酮和乙醇进行固定，然后用FITC标记的单克隆抗体进行染色，洗涤后在荧光显微镜下，结果ARV S1733感染的鸡胚成纤维细胞出现荧光，而用SP2／0骨髓瘤培养上清以及没有感染的细胞没有出现荧光（图3）。

图3 直接免疫荧光法检测 MAbs SB2－1与感染禽呼肠病毒S1733的反应结果Fig.3 Direct immunofluorescence detection of fibro cells infected with Reo S1733strain by MAbs SB2－1

2.8 病毒中和试验

将单克隆抗体倍比稀释后与相同体积的200 EID50／0.2mL的ARV S1733毒株充分混匀感染鸡胚成纤维细，结果所有稀释的单抗组与病毒对照一样均出现细胞病变，而阴性对照则没有细胞病变；用直接免疫荧光（FA）方法进行染色检测，在荧光显微镜下，试验组与阳性病毒组一样出现荧光，阴性对照没有荧光出现。

3 讨论

在畜禽传染病方面，已有很多单克隆抗体的制备和鉴定［12－13］。正是由于单克隆抗体具有特异性高、敏感性强的特点，已被广泛应用于各类传染病病原的血清学检测和诊断中。本研究是根据禽呼肠病毒在检测方面的需要，有针对性地进行单克隆抗体的制备和特性鉴定，从而为进一步建立快速诊断技术奠定基础。

进行单克隆抗体的制备，病毒的纯化非常关键，各种病毒的纯化根据需要有各自不同的方法，本研究所用的病毒是鸡胚增殖的病毒，其病毒含量不够纯，在病毒纯化是首先采用低速离心，去掉一部分的杂物，然后采用病毒浓缩仪和过滤器进行浓缩，将大部分的水分去掉，再通过蔗糖密度梯度离心，获得的纯化病毒，其纯度较高，在用于免疫和包被抗原时，可以尽可能排除非特异反应。另外，通过这样纯化而获得的病毒，其病毒结构的构象没有发生变化，排除了因直接超速离心浓缩而带来的病毒结构构象的改变，从而在免疫时因构象改变而产生的其它分泌抗体的产生。

本试验采用FITC直接标记的单克隆抗体进行染色，在细胞培养时，适当降低培养液中血清的浓度，在接毒时延长病毒与细胞的吸附时间和洗涤时间，这样尽可能地排除了假阳性结果的出现，提高了鉴定效率。

本试验中，应用Dot－ELISA方法对制备的单克隆抗体与对照的 NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV 进行特异性检测，均无交叉反应，证明制备的单克隆抗体有良好的特异性。可以应用本试验制备的单克隆抗体，建立用于特异性检测禽呼肠病毒的试剂盒，为鉴别诊断禽呼肠病毒奠定了基础。

本试验通过病毒中和试验，证明本研究制备的单克隆抗体不具有中和禽呼肠病毒的能力，由此可以推断其识别的线性表位不是中和表位，只能识别禽呼肠病毒抗原的表位。本试验得到的mAb虽然不具有中和病毒的活性，但具有特异识别禽呼肠病毒的功能，因此，在建立准确诊断由禽呼肠病毒引起的疫病方面将会发挥重要的作用。

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