狂犬病病毒RT-LAMP检测方法的建立

何 媛，罗宝正，邵建宏，薄清如，徐海聂，林瑞庆，沙才华，廖秀云，陈步雲

（1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.珠海出入境检验检疫局，广东珠海519015：3.珠海市香洲区宠物行业协会，广东珠海519015）

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus）引起的一种人兽共患的急性致死性中枢神经系统的自然疫源性疾病。一旦发病，病死率几乎达100%。我国是受狂犬病威胁严重的国家之一，20 世纪50年代以来狂犬病在我国出现了3次流行高峰，20世纪80年代发病高峰后，疫情在1998年又有抬头趋势，2007年达到了第3次高峰［1］。狂犬病的预防与控制已成为严重的公共卫生问题。建立狂犬病病毒检测技术，对其进行快速检测，对该病的防控有重要作用。

环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi T 等［2］建立的新式恒温核酸扩增方法，利用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA 聚合酶（BstDNA polymerase），在63℃左右对核酸进行恒温扩增。添加一对环引物，可以使LAMP 反应耗时缩短约一半［3］。检测结果可通过添加染色剂用肉眼判定，简便直观。RT-LAMP灵敏快速，操作简单方便，只需水浴锅或恒温金属浴即能完成整个反应，不需要专门仪器，适于基层应用。因此，建立针对狂犬病病毒的一步式RT-LAMP病毒核酸检测技术，对狂犬病进行快速、准确诊断，且使狂犬病病毒的基层检测成为可能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 狂犬病病毒弱毒（E3株）、犬瘟热病毒弱毒（R-20／8 株）、犬副流感病毒弱毒（A-20／8株）、犬腺病毒（YCA18 株）、犬细小病毒弱毒（CR86106株）均为疫苗毒，为吉林五星动物保健药厂提供。

1.1.2 主要试剂与仪器 RNA 核酸恒温扩增试剂盒、荧光染料（钙黄绿素与氯化锰）均为广州迪澳（DEAOU）公司产品；Mag-Bind Viral DNA／RNA Kit（200）为OMEGA 公司产品；TaKaRa One step RT-PCR Kit Ver.2 为宝生物工程（大连）有限公司产品；ABI 7500Real-time PCR System 为美国Applied Biosystems公司产品；高速冷冻离心机为德国Sigma公司产品；恒温金属浴，ND-1000微量分光光度计，超净工作台，移液器，微型振荡器。

1.2 方法

1.2.1 狂犬病病毒RT-LAMP 引物设计与合成根据GenBank中的RV 基因组序列，进行多序列比对，以N 基因上的一段高度保守区作为扩增对象，然后通过LAMP 引物设计软件Primer design V4（http：／／primerexplorer.jp／）设计，引物序列见表1。引物由上海Invitrogen生物科技有限公司合成，采用HPLC纯化方式。引物用灭菌DEPC水稀释成100pmol／μL溶液，置-20℃保存，所设计LAMP引物见表1，Real-time RT-PCR引物见表2［4］。

表1 狂犬病病毒RT-LAMP引物Table 1 RT-LAMP primers for detection of rabies virus

表2 狂犬病病毒Real-time RT-PCR引物和探针Table 2 Sequence and probe of Real-time RT-PCR primers for detection of rabies virus

1.2.2 病毒RNA 的提取 狂犬病病毒（E3株）的RNA 提取，按照磁珠提取试剂盒说明进行。同时提取等量犬瘟热病毒（R-20／8株）、犬副流感病毒（A-20／8 株）、犬 腺 病 毒（YCA18 株）、犬 细 小 病 毒（CR86106株）核酸。加入适量RNA 酶抑制剂，置-20℃冻存备用。

1.2.3 RT-LAMP反应 按照迪澳恒温扩增试剂盒添加反应体系，体系中含荧光染料。调节引物浓度，得出最佳浓度：一对外引物F3、B3 分别为5 pmol／μL，一对环引物LF、LB 分别为10pmol／μL，一对内引物FIP、BIP分别为20pmol／μL。配制好的体系加入封闭液，盖上管盖。置于恒温金属浴中63℃40mm。

1.2.4 RT-LAMP的特异性 将提取的狂犬病病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、犬细小病毒的RNA，分别加入5 管已配好的RT-LAMP 体系中，进行RT-LAMP检测，观察管内颜色变化。

1.2.5 RT-LAMP和Real-time RT-PCR检测狂犬病病毒比较 将狂犬病弱毒（E3 株）10 倍倍比稀释，得到稀释梯度分别为100～10-10样品共11个。再用磁珠法提取RNA，分别进行RT-LAMP和Real-time RT-PCR 检 验。Real-time RT-PCR 反 应 程序为：50℃30min；94℃2min；然后94℃10s，55℃40s，扩增40 个循环；其中在55℃复性和延伸40s时收集荧光信号［4］。

1.2.6 稳定性试验狂犬病弱毒（E3 株）100～10-10共11个梯度，每个做3次重复，用建立的方法进行检测。4周后再次进行检测，验证批内及批间稳定性。

1.2.7 临床样品检测 在珠海出入境检验检疫局技术中心疫苗注射室随机采取未注射狂犬疫苗的犬唾液样品66份，在珠海市宠物医院采取收养流浪犬的唾液样品20份，在动物药品市场分别购买农业部百司特5联弱毒活疫苗、Rabisin-R 瑞贝康狂犬病疫苗、Intervet Nobivac犬猫狂犬病灭活疫苗各2份样品，用建立的方法分别对以上样品进行检测。

2 结果

2.1 狂犬病病毒RT-LAMP方法的建立

在25μL反应体系中（含钙黄绿素与氯化锰），于反应管中加入病毒模板，同时设置阴性对照，置于恒温金属浴进行RT-LAMP 扩增。用肉眼判定，加入病毒模板反应管呈现明显的翠绿色，而阴性对照则为淡橙色（图1）。

图1 狂犬病毒的RT-LAMP检测结果Fig.1 RT-LAMP detection of rabies virus

2.2 RT-LAMP检测狂犬病病毒的特异性

用不同病毒RNA 作为模板，仅含狂犬病病毒RNA 的管内颜色为翠绿色，即阳性。其他病毒管内颜色均为淡橙色，即阴性（图2）。

2.3 RT-LAMP 和Real-time RT-PCR检测狂犬病病毒比较

将稀释度分别为100～10-10的RNA 为模板分别进行RT-LAMP 和Real-time RT-PCR。Real-time RT-PCR 最后检测稀释度为10-6处，稀释度10-7处判为可疑（曲线中35个循环后才扩增出可检测到的量）（图3）。而RT-LAMP 变色的最低稀释度为10-7，能检测到样品稀释度10-7（图4），以ND-1000微量分光光度计测定样品稀释度10-6、10-7的狂犬病病毒RNA 浓度，分别为1.2ng／μL、0.3 ng／μL。

2.4 稳定性试验

狂犬病病毒（E3株）稀释梯度100～10-7均显翠绿色为阳性，稀释梯度10-8～10-10样品均显淡橙色为阴性，说明本实验建立的方法稳定性良好。

2.5 临床样品检测

86份唾液样品全为流浪犬，66份未注射狂犬病疫苗犬唾液样品未检出阳性（0／66），20份流浪犬唾液样品检出3份阳性（3／20），6份疫苗全部出现阳性（6／6）。86份唾液样品和6份疫苗样品检测结果同预期目标基本一致，表明建立的方法可靠稳定，可用于临床对狂犬病病毒的检测。

图3 狂犬病病毒的Real-time RT-PCR灵敏度检测结果Fig.3 The sensitivity detection of Real-time RT-PCR assay for RV

图4 狂犬病病毒的RT-LAMP灵敏度检测结果Fig.4 The sensitivity detection of RT-LAMP assay for RV

3 讨论

传统RT-PCR 方法、免疫组织化学方法均不适用于狂犬病临床样品的准确、快速检测的需要。而荧光定量PCR检测方法的出现提供了一种敏感、特异、快速、高通量检测手段，但需要昂贵和操作繁琐的仪器，难以实现基层推广应用。

本研究将RT-LAMP与Real-time RT-PCR 进行比较，RT-LAMP的灵敏度略高于Real-time RTPCR；因Real-time RT-PCR 出现扩增曲线的最后一个稀释度10-7，于35 个循环后才开始检测到荧光，且扩增量不多。如果进行样品的检测，仅判为疑似，因为不排除假阳性的可能。需再次进行重复试验或其他试验加以验证。而RT-LAMP一旦扩增，通过管内颜色变化可以明显看出（本试验还将LAMP反应管置于荧光PCR 仪中反应，观察反应扩增曲线，得出反应管颜色变化与曲线扩增情况完全一致）。钙黄绿素与锰离子作为荧光染色剂用于LAMP 扩增，其判断结果与浊度判断结果也一致［5］。且其多对引物保证了RT-LAMP的特异性，故Real-time RT-PCR检测灵敏度判为10-6，所检测RNA 浓度为1.2ng／μL；而RT-LAMP 检测灵敏度为10-7，所检测RNA 浓度为0.3ng／μL，RTLAMP的灵敏度略高于Real-time RT-PCR。国内外都有相同研究报道［6-7］。然而，也有研究显示RTLAMP方法的敏感性与Real-time PCR相当［8-9］。甚至有研究表明，LAMP 的灵敏度不及Real-time PCR［10］。这可能与样品中病毒含量有较大关系，也与核酸提取纯度关系密切。总而言之，RT-LAMP比Real-time RT-PCR快速、简便，这都使得它成为极具发展潜力的、适于基层和现场的一种疾病病原检测技术。

LAMP结果的判定方法有多种，包括副产物——焦磷酸镁的浊度检测，反应后加入荧光染料，用肉眼进行扩增结果判定，琼脂糖电泳检测［11］。对焦磷酸镁的浊度检测，用肉眼是很难观察到的，日本已研制出专门对LAMP 产物进行实时监控的浊度仪［12］。但如果用专门的浊度仪进行观察，就增加了LAMP的成本，不利于基层的使用以及该方法的普及。也有相关研究显示，可以加入硫酸铜替代电泳和浊度计［13］。目前已建立起的狂犬病病毒RTLAMP技术［14-15］，于反应终止后加入SYBR GreenⅠ染料，也就意味着需要开盖。针对LAMP巨大的产物量是极易污染的，这样就加大了LAMP技术的使用难度。而将产物进行电泳，也面临着随时污染的可能性，都不利于LAMP技术的长期使用。因为LAMP的扩增产物本身也是模板，产物扩增量极大，且反应是在恒温下进行的。所以，如果在同一个地方重复多次试验，前次反应的产物很容易污染后面的试验，造成假阳性。然而，这个问题可以通过本试验的不开盖的方式进行产物检测而得到克服。本研究采用钙黄绿素和氯化锰的混合物作为荧光染料，在配置反应体系时加入，无需开盖就可以用肉眼观察结果［16］。封闭性反应系统既可以避免污染，又省去了耗时耗力的电泳分析。结果的易读取性是简化和普及此法的重要因素之一。

在样品检测时我们发现LAMP 肉眼判定结果很直观，但有时反应管颜色变化微弱，以至于无法准确判定结果。本研究把加入染料的LAMP 反应管置于荧光定量PCR 仪中对反应进行实时监测以验证结果，发现尽管反应管变色微弱，但是在荧光定量PCR 仪中的扩增曲线却是极高的。通过这个监测，我们可以推测出，只要LAMP管内出现哪怕十分微弱变色，也能判定其为阳性。且通过荧光检测更避免了通过电泳验证LAMP 产物易造成的气溶胶污染，所以保证了检测结果的可信度。然而LAMP反应管变色微弱，不排除染料问题如混合染料比例不当、染料使用时间过长、保存不当，以及样品病毒含量本身过低等原因造成显色不明显。

当前，LAMP 用于病毒、细菌、寄生虫等的快速、灵敏、特异检测和其他方面的检测已经成为热点。而且Bst聚合酶对血液、细胞培养液等各种物质表现出比Taq聚合酶更高的耐受性，对于DNA的检测来说，或许能省略核酸抽提就能达到检测的目的［17］，这就增加了LAMP 检测的简易性。本研究建立的狂犬病病毒的RT-LAMP 检测技术具有快速、简便、灵敏度高、结果可视化等优点，既适用于批量样品的检测及一般实验室的检测，也使基层及现场检测成为了可能，具有很高的实用价值。

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