茶皂素与四种抗菌药物的体外联合抗菌效果研究

潘任桃，卢素云，刘兆颖，孙志良

（湖南农业大学动物医学院 国家植物功能成分利用工程技术研究中心生物兽药分中心，湖南长沙410128）

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌是引起感染的主要病原菌，为了有效的防治由大肠埃希菌、金黄色葡萄菌引起的感染，多采用联合用药的方式，兽医临床上有庆大霉素＋磷霉素，恩诺沙星＋头孢三嗪，氟苯尼考＋盐酸土霉素等［1－5］。随着大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌对相关抗菌药物敏感性降低，抗菌药物的使用剂量也不断加大［6］。茶皂素是从山茶科植物中提取出来的天然活性物质［7－8］，具有代谢快、残留少、毒性低等特性，可提高动物机体免疫力，降低胆固醇含量，增加料肉比等优点［9－10］，目前作为一种饲料添加剂广泛应用于养殖行业。茶皂素具有较强的杀钉螺［11］、杀 真 菌 能 力［12］，也 具 有 一 定 的 抗 细 菌 效果［13］，目前尚未见到关于茶皂素与抗菌药物联合用药的研究报道，本试验旨在通过观察茶皂素与相关抗菌药物的联合抑菌效果，探讨动物细菌性疾病治疗的药物组合。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 庆大霉素标准品，批号CDRC－G360595，由中国兽药监察所提供；氟苯尼考原料药，批号200907001，宁夏太平洋生物制药有限公司产品；恩诺沙星原料药，批号Z05721－2，湖南麓谷医药制品有限公司产品；氨苄青霉素，批号B110－00614，上海创赛仪器有限公司产品；茶皂素，含量93.5%，湖南农业大学提供；琼脂粉，批号100115，上海蓝季科技发展有限公司产品；蛋白胨，批号080410，上海蓝季科技发展有限公司产品；酵母粉，批号LP0021，英国Oxoid公司产品；营养琼脂，批号080310，北京陆桥技术有限责任公司产品；氯化钠，批号F20100330，国药集团化学试剂有限公司产品；MTT试剂盒，批号C0009，碧云天生物技术研究所产品。

1.1.2 试验菌株 致病性大肠埃希菌和耐药金黄色葡萄球菌，由湖南农业大学兽药工程研究所提供。

1.1.3 主要仪器 SW－CJ－2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备公司产品；LRH－250－S型恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂产品；Infinite F50酶标仪，瑞士TECAN；DHG－9240A型电热鼓风干燥箱，上海精宏试验设备有限公司产品；YXQ－LS－50SⅡ型立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博迅公司医疗设备厂产品；HHSY11－Ni2型电热恒温水浴锅，北京长源实验设备厂产品；AY22O型电子天平，日本Electronic Balance公司产品；微量可调移液器，德国Eppendorf公司产品。

1.2 方法

1.2.1 抗菌药物储备液的配置 准确称取庆大霉素、氟苯尼考、恩诺沙星，分别配置成浓度为3 000、1 600、480μg／mL 的 母 液；氨 苄 青 霉 素 稀 释 成100μg／mL，备用。其中，氟苯尼考用酒精助溶，恩诺沙星用NaOH助溶。

1.2.2 菌悬液的配置 菌种复苏，培养24h，平板计数法进行细菌计数后，用LB培养基配置成1×105cfu／mL。

1.2.3 最小抑菌浓度测定

1.2.3.1 琼脂稀释法 琼脂稀释法药敏试验和结果判读按照新版CLSI［14］推荐的琼脂稀释法进行，设置3个重复。分别测定庆大霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、氨苄青霉素对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），菌悬液浓度为1×105cfu／mL，各药物设置12个浓度，置37℃恒温恒湿培养箱培养18h～24h，观察结果，以无菌生长的最低浓度为该药单独用药时的MIC。

1.2.3.2 多孔板－MTT比色法 参照微量肉汤稀释法测定各抗菌药物单独用药时的MIC值。将各药物以灭菌LB倍比稀释成12个浓度，分别取100μL依次加入96孔板，再将1×105cfu／mL菌液100μL加入孔中，37℃过夜培养18h～24h，加入5mg／mL的MTT 10μL，继续培养4h，加入100μL溶解液，培养15min，酶标仪570nm处测定吸光值A。以被抑制达75%的孔的药液质量浓度作为该药物的MIC值。各药物浓度设置3个重复［14－15］。

1.2.4 联合药敏试验 采用多孔板－MTT比色法，按照棋盘法设置药物浓度（3个重复），分别测定茶皂素与庆大霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、氨苄青霉素的联合体外抗菌活性，以各药物对应MIC值的2、1、1／2、1／4、1／8倍等浓度分别进行联合药敏试验。置37℃恒温恒湿培养箱培养18h～24h，观察结果。

试验结果以分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration，FIC）指数作为联合药敏试验的判断依据：FIC≤0.5为协同作用；0.5＜FIC≤1为相加作用；1＜FIC≤2为无关作用；FIC＞2为拮抗作用。

2 结果

2.1 单独用药的最小抑菌浓度

由表1可知，多孔板－MTT比色法和琼脂稀释法的结果一致率为87.5%；且与4种抗菌药物相比，茶皂素的 MIC值较大，为0.8×105μg／mL。

2.2 体外联合药敏试验结果

由表2、表3可知，茶皂素与试验所用抗菌药物表现为相加作用，联合用药后，庆大霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、氨苄青霉素、茶皂素对大肠埃希菌的MIC值分别为单独用药的1／64、1／32、1／64、1／32、1／2；对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为单独用药的1／32、1／8、1／4、1／8、1／2。

3 讨论

多孔板－MTT比色法是通过细胞琥珀酸脱氢酶等将黄色的MTT变成紫色的甲臜，在OD 570nm处测定其吸光值，OD值的大小与活细胞含量成正比，死细胞没有此功能，因此，MTT法可用于测定活细胞含量［14－15］。琥珀酸脱氢酶等是细胞代谢反应中最基本的酶系之一，在哺乳动物细胞中仅存在于线粒体，参与三羧酸循环的脱氢反应；而在细菌中，琥珀酸脱氢酶存在于质膜、间体，因此MTT不仅可用于细胞试验，还可用于细菌、真菌试验，提示MTT可用于抗菌药物MIC值测定［16－17］。且与琼脂稀释法相比，多孔板－MTT比色法所需样品含量少，能对多个样品进行快速检测，进行结果判读所得的MIC值更为准确、客观，结果可量化。

表1 5种药物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度Table 1 The MIC of five kinds of antimicrobials against E.coli and Staphylococcus aureus μg／mL

表2 茶皂素与4种抗菌药物对大肠埃希菌的体外联合试验Table 2 Sensitivity effects of tea saponin combined with four kinds of antimicrobials against E.coli in vitro μg／mL

表3 茶皂素与4种抗菌药物对金黄色葡萄球菌的体外联合试验Table 3 Sensitivity effects of tea saponin combined with four kinds of antimicrobials against Staphylococcus aureus in vitro μg／mL

单一用药结果显示，多孔板－MTT比色法与琼脂稀释法的结果一致率达到87.5%，因此在联合用药过程中，为了使结果更为准确，加快试验进度，采取多孔板－MTT比色法。从试验结果可看出，联合用药中FIC值都在0.5～1，属于相加作用，药物的MIC值较单独用药时的MIC值都有不同程度的降低：茶皂素联合用药时的MIC为单独用药的1／2，4种抗菌药物联合用药时的MIC为单独用药时MIC的1／4～1／32，抗菌药物的使用量都得到大幅度的降低。这4种抗菌药物的杀菌机理各有差异，抑制蛋白质的合成、阻碍DNA的复制、增大细胞壁的通透性［18－19］。联合用药中，茶皂素的增效作用可能是茶皂素的表面活性剂性质［20］加大了抗菌药物与细菌接触的表面积，提高了抗菌药物的有效作用浓度；也有可能是其对细菌造成的氧化性损伤［21］，增强了病原菌对抗菌药物的敏感性。

由此可见，茶皂素与抗菌药物联合用药，可扩大抗菌药物的抗菌谱、减少抗菌药物的用量，可望治疗混合感染。

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