副猪嗜血杆菌河南分离株的鉴定及培养特性分析

李书光，段笑笑，苗立中，李 峰，沈志强，单 虎

（1.青岛农业大学，山东青岛266109；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600；3.山东省预防兽医学重点实验室，山东青岛266109）

病原菌引起的呼吸道疾病严重制约着规模化养殖场的健康发展。近年来，在世界范围内副猪嗜血杆菌引发保育猪严重的呼吸道疾病，已经造成了巨大的经济损失［1］。副猪嗜血杆菌为巴氏杆菌属的革兰阴性短小杆菌，能够在健康猪的鼻黏膜和扁桃体等上呼吸道区域检测到［2］。一些菌株能够移行至肺部，引起肺炎，进而引起全身性疾病，表现为特征性的纤维素性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等，被称为Glässer＇s病［3］。国内外使用琼扩法将副猪嗜血杆菌分为15个血清型，但是目前仍有较大数量的分离菌株不能够用琼扩法进行分型；利用ERIC－PCR技术，15个参考菌株表现为唯一独特的指纹图谱，对分离株的分型率可以达到100%［4］。目前研究显示副猪嗜血杆菌的病原性和血清型之间没有必然的联系，但是常规的划分方法血清型1、5、10、12、13、14为高毒力菌株，2、4、15为中等毒力菌株，3、6、7、8、9、11为无毒力株［5］。研究者一致认为，长途运输、环境的突变、断奶等一些应激能够引起副猪嗜血杆菌病的暴发，特别是在带有强毒力菌株的猪群［6］。

大多数的猪群都有副猪嗜血杆菌的隐性感染，因此猪群会有一定的免疫保护力，用该猪群进行全身感染的病例复制是不可能实现的，通过剖腹产不吃初乳或者顺产不吃初乳的仔猪可以成功地复制副猪嗜血杆菌病例［7］。目前防控该病的传统方法为使用商品疫苗或者自家苗，疫苗对同种血清型的细菌侵染具有很好的保护力。

1 材料与方法

1.1 材料

疑似副猪嗜血杆菌病料采自河南新乡；胰大豆琼脂（TSA和TSB）培养基为美国BD公司产品；HPS2型、5型、7型标准血清由华中农业大学惠赠；芬兰Bioscreen全自动微生物生长曲线测定仪为上海谓载商贸发展有限公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NAD，NAD）为上海生物工程公司产品；牛血清为浙江天杭生物科技有限公司产品；马血清和猪血清均为兰州民海生物工程有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯；豚鼠为北京实验动物研究中心产品。

1.2 方法

1.2.1 分离株的分离及PCR鉴定 将病料的心包积液、关节液和脑组织等匀浆划线接种于含NAD的TSA培养基上，37℃厌氧罐中初代培养48h后观察细菌生长情况，挑取疑似单个菌落，进行纯培养，革兰染色镜检，并使用上游引物 HPS1：GTGATGAGGAAGGGTGGTGT，下游引物 HPS2：GGCTTCGTCACCCTCTGT进行PCR鉴定。1.2.2 分离株培养特性

1.2.2.1 3种有机氮源对HPS生长的影响 加入50mg／L NAD未加入胰蛋白胨的TSB培养基，以0、8、17、26g／L等4个梯度分别加入胰蛋白胨、蛋白胨和酵母浸粉3种不同的有机氮源混匀，取380μL加入培养板中，设置3个重复，接种副猪嗜血杆菌18hTSB培养物20μL，将培养板放入全自动微生物生长曲线测定仪中进行培养、监测。

1.2.2.2 2种无机氮源对HPS生长的影响 加入50mg／L NAD的TSB培养基，以2、4、6、8g／L等4个梯度分别加入硫酸铵和氯化铵2种不同无机氮源混匀，取380μL加入培养板中，设置3个重复，接种副猪嗜血杆菌18hTSB培养物20μL，将培养板放入全自动微生物生长曲线测定仪中进行培养、监测。

1.2.2.3 不同的碳源对 HPS生长的影响 加入50mg／L NAD未添加葡萄糖的TSB培养基，以0、1、2.5、5g／L等4个梯度分别加入葡萄糖、乳糖和麦芽糖3种不同的碳源混匀，取380μL加入培养板中，设置3个重复，接种副猪嗜血杆菌18hTSB培养物20μL，将培养板放入全自动微生物生长曲线测定仪中进行培养、监测。

1.2.2.4 不同的动物来源血清对HPS生长的影响

加入50mg／L NAD的 TSB培养基，以0、10、25、50mL／L等4个梯度分别加入牛血清、马血清和猪血清3种不同的碳源混匀，取380μL加入培养板中，设置3个重复，接种副猪嗜血杆菌18hTSB培养物20μL，将培养板放入全自动微生物生长曲线测定仪中进行培养、监测。

1.2.2.5 不同浓度的NAD对HPS生长的影响未加入 NAD的 TSB培养基，以0、25、50、75mg／L 4个梯度加入NAD混匀，取380μL加入培养板中，设置3个重复，接种副猪嗜血杆菌18hTSB培养物20μL（50mg／L的NAD含量），将培养板放入全自动微生物生长曲线测定仪中进行培养、监测。

1.2.3 分离株对豚鼠致病性及药物敏感性分析用8只豚鼠，随机分为3组，试验1组3只，试验2组3只，对照组2只。试验1组每只豚鼠腹腔注射1mL 1.0×108cfu／mL HPS，试验2组每只豚鼠注射1mL 1.0×109cfu／mL的HPS，对照组每只豚鼠注射1mLTSB，连续观察7d。期间死亡的豚鼠剖检观察，并作细菌分离和PCR检测。7d后处死存活的豚鼠和对照组，观察临床病理变化，分离病原。

无菌放置干燥抗菌药物纸片紧贴于密集划线接种了菌种的培养基表面，每个直径90mm的平皿贴7个药敏纸片、盖上平皿，倒置平皿置37℃温箱培养24h，取出测量观察结果，判断标准按2010版CLSI M100－S20执行。

2 结果

2.1 病原菌的分离及PCR检测

分离到的病原菌在添加NAD的TSA培养基生长48h后呈光滑、无色透明、露珠状、扁平的、直径1mm小菌落。革兰染色阴性，多呈短杆状、有的呈球杆状（图1）。纯化后的细菌，使用副猪嗜血杆菌检测引物进行PCR鉴定，获得800bp左右的片段（图2）

图1 分离菌的革兰染色镜检（1 000×）Fig.1 The bacterial isolate by Gram strain（1 000×）

图2 副猪嗜血杆菌PCR鉴定结果Fig.2 PCR identification of HPS

2.2 病原菌的培养特性

2.2.1 有机氮源 胰蛋白胨、蛋白胨和酵母浸粉以0、8、17、26g／L等4个梯度加入未加胰蛋白胨的TSB培养基中，接种后在全自动微生物曲线测定仪上培养检测18h的试验结果分别见图3；从图3中可以看出以蛋白胨26g／L组生长效果最好，酵母浸粉26g／L组次之。

2.2.2 无机氮源 氯化铵和硫酸铵分别按照2、4、6、8g／L等4个梯度加入添加入TSB培养基中，接种后在全自动微生物曲线测定仪上培养检测18h的试验结果分别见图4；从图4中可以看出硫酸铵2g／L组效果最好，且较之未作任何添加物的胰蛋白胨17g／L组有明显的提升作用。

图3 有机氮源浓度筛选Fig.3 The screening of organic nitrogen concentration

图4 无机氮源浓度筛选Fig.4 The screening of inorganic nitrogen source concentration

2.2.3 碳源 加入NAD的未添加葡萄糖的TSB培养基，以0、1、2.5、5g／L等4个梯度分别加入葡萄糖、乳糖和麦芽糖3种不同的碳源混匀，接种后全自动微生物生长曲线测定仪中进行培养、监测，结果见图5。图5中可以看出以麦芽糖2.5g／L组效果最好。

2.2.4 血清 加入NAD的TSB培养基，以0、10、25、50mL／L等4个梯度分别加入牛血清、马血清和猪血清，全自动微生物生长曲线测定仪中进行培养、监测结果见图6。图6中可以看出3种血清的添加量均对该菌株的生长有影响，且3种血清中以50mL／L组效果均较好。

2.2.5 不同浓度的NAD对HPS生长的影响 未加入 NAD的 TSB培养基，以0、25、50、75mg／L 4个梯度加入NAD混匀，全自动微生物生长曲线测定仪中进行培养、监测结果见图7。因种子液中的NAD含量为50mg／L，4个梯度实际含量为2.5、27.5、52.5、77.5mg／L。图7中可以看出，NAD实际添加量为27.5mg／L的效果最好，高浓度的反而生长不好。

2.3 豚鼠致病性及药物敏感试验

试验1组3只豚鼠在攻毒后出现高度的精神不振，1周内未发生死亡；试验2组3只豚鼠在攻毒后第1天死亡2只，第2天死亡1只，死亡的豚鼠肝脏能够分离到副猪嗜血杆菌；对照组无任何症状。对死亡豚鼠剖检，可以观察到肺脏有明显的出血点，但是无其他特征性的病变；1周后处死试验1组和对照组的豚鼠，剖检结果显示，对照组无任何病变；试验1组，肺脏有弥漫性出血点，并有实变和肿胀，肝脏肿胀、充血，但均未见浆膜炎症状。

药敏试验结果显示，阿奇霉素为低敏感度药物，头孢曲松为高敏感度药物，其他药物为敏感药物（表1）。

3 讨论

图5 碳源浓度筛选Fig.5 The screening of carbon source concentration

图6 最佳血清浓度筛选Fig.6 The screening of optimal serum concentrations

副猪嗜血杆菌的血清学分布具有一定的地域性，据报道中国南部地区，血清5型和4型是主要的流行血清型，其比例为23%和17%；血清2型（8%）、15型（7%），13 型（6%）和12 型（5%）都占一定的比例；另外有20%的菌株无法分型［8］。在针对副猪嗜血杆菌毒力基因的研究中，capD基因编码多糖生物合成蛋白，在试验中证实其为一种新发现的毒力决定基因，该基因的存在与否一定程度上决定了副猪嗜血杆菌的毒力和血清抵抗力，可以作为鉴别副猪嗜血杆菌毒力的标记［9］。国内外开展了针对副猪嗜血杆菌多种检测方法的研究工作，LAMP检测方法的建立使该病原的检测更加便捷［10］。在亚单位疫苗的研发中，研究证实外膜蛋白（OMPs）rGAPDH、rOapA、rHPS－0675能够诱导针对副猪嗜血杆菌SH0165的免疫保护；NPAPT作为免疫抗原的免疫保护作用也有报道；副猪嗜血杆菌具有巴氏杆菌属致病菌的抗吞噬作用，借助高致病性副猪嗜血杆菌基因文库的构建和肺巨噬细胞的互作，筛选到了VtaA8和VtaA9两个具有抗吞噬作用的表面蛋白［11］；主要外膜蛋白（OMP）的可溶性产物能够诱导模型动物产生抵抗副猪嗜血杆菌感染的保护力［12］；这些研究工作均有助于副猪嗜血杆菌的科学防控和新的候选疫苗研究开发工作。

图7 NAD最佳工作浓度筛选Fig.7 The screening of optimal NAD work concentration

表1 药物敏感性试验结果Table 1 Drug susceptibility test results

本研究中，探讨了单因素对该菌株的培养特性的影响。NAD添加试验中，未添加NAD组生长也较好，可能是由于种子培养基中NAD含量过高（50mg／L），接种的培养基中残留的NAD能够促使其生长，本试验中筛选到的较好的NAD含量经换算可知为27.5mg／L。预设添加NAD的培养基中，探讨培养基中3种血清的浓度对HPS生长的影响，结果表明，3种血清对HPS的生长有促进作用，且较高浓度OD 600nm值均达到0.57以上；氮源选择方面，蛋白胨高浓度的试验效果最好，硫酸铵2g／L的添加对该菌株的生长具有较好的促进作用；碳源以2.5g／L的添加量效果最好。

前期研究中，王大鹏等［13］采用3周龄～4周龄HPS阴性健康仔猪作为试验用动物，攻毒后使仔猪出现食欲下降，体温升高，皮下出血，被毛粗乱，关节肿胀，跛行等临床症状；但是由于母源抗体的影响，只有少数未吃初乳的仔猪可以用作动物模型。该分离株对豚鼠具有一定的致病性，在下一步的疫苗研制中，对后续的动物模型建立具有重要的参考价值。

［1］ 耿万友，付作宽，周 霞，等.副猪嗜血杆菌病研究进展［J］.动物医学进展，2012，33（12）：161－164.

［2］ 李淑芳，张培君，龚玉梅，等.副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白研究进展［J］.动物医学进展，2012，33（8）：77－80.

［3］ Pina S，Olvera A，BarcelÓ A，et al.Trimeric autotransporters ofHaemophilusparasuis：generation of an extensive passenger domain repertoire specific for pathogenic strains［J］.Bacteriol J，2009，191：576－587.

［4］ 万世平，王 建，葛菲菲，等.副猪嗜血杆菌上海分离株的生物学特性与基因型分析［J］.畜牧与兽医，2010，42（4）：65－68.

［5］ Oliveira S，Pijoan C.Haemophilusparasuis：new trends on diagnosis，epidemiology and control［J］.Vet Microbiol，2004，99：1－12.

［6］ Nedbalcova K，Satran P，Aglic Z.Haemophilus parasuis and Glasser＇s disease in pigs：a review［J］.Vet Med，2006，51：168－179.

［7］ Oliveira S，Galina L，Blanco I，et al.Naturally farrowed，artificially reared pigs as an alternative model for experimental infection by Haemophilus parasuis［J］.Can J Vet Res，2003，67：146－150.

［8］ Zhang J，Xu C，Guo L，et al.Prevalence and characterization of genotypic diversity of Haemophilus parasuis isolates from southern China［J］.J Vet Res，2012，76（3）：224－229.

［9］ Wang X，Xu X，Wu Y，et al.Polysaccharide biosynthesis protein CapD is a novel pathogenicity－associated determinant of Haemophilus parasuis involved in serum－resistance ability［J］.Vet Microbiol，2013，2（5）：S0378－1135.

［10］ Zhang J M，Shen H Y，Liao M，et al.Detection of Haemophilus parasuis isolates from South China by loop－mediated isothermal amplification and isolate characterization［J］.J Vet Res，2012，4（24）：E1－6.doi：10.4102／ojvr.v79i1.383.

［11］ Costa－Hurtado M，Ballester M，Galofré－MilàN，et al.VtaA8 and VtaA9from Haemophilus parasuis delay phagocytosis by alveolar macrophages［J］.Vet Res，2012，43（1）：57.

［12］ Ahn J，Hong M，Yoo S，et al.Soluble expression of OmpA from Haemophilus parasuis in Escherichia coli and its protective effects in the mouse model of infection［J］.J Microbiol Biotechnol，2012，22（9）：1307－1309.

［13］ 王大鹏，吴家强，于 江，等.副猪嗜血杆菌血清5型分离株生长曲线与致病力研究［J］.西南农业学报，2011，24（5）：1972－1976.