动物源空肠弯曲杆菌的分离及耐药性试验

杨胜男 ，王 娟，郑增忍＊，张乐萃，曲志娜 ，黄秀梅，李玉清

（1.青岛农业大学，山东青岛266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032）

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是弯曲杆菌属的一种，是一种近十几年来受到国内外广泛重视的人畜共患病病原菌，主要引起人体急性肠炎和食物中毒，并伴发反应性关节炎、肝炎、瑞特氏病和格林－巴利综合征等免疫性损伤性疾病。在兽医临床中，可引起家畜流产不孕、乳房炎及幼畜禽腹泻和家禽肝炎［1－9］。自20世纪70年代起，空肠弯曲杆菌就是引起肠道感染的主要原因之一，由此引发的食品安全和食源性疾病问题日益突出，严重威胁人畜健康，成为公共卫生关注的焦点［10］。随着抗生素的广泛不合理使用，弯曲杆菌耐药性问题引起了世界的广泛关注。因此，了解空肠弯曲杆菌的耐药菌株情况，是保障公共卫生及养殖业健康发展的重要举措。本试验对采集的样品分离纯化并对其进行药物敏感性试验分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测样本及来源 从青岛地区不同屠宰场及农贸市场采集鸡盲肠（内容物样品），猪盲肠棉拭子（置于Cary－Blair半固体培养基中），共170份，低温运送至实验室。

1.1.2 试剂及培养基 CCDA琼脂、哥伦比亚血琼脂基础购自英国OXOID公司；绵羊全血购自青岛海博生物科技公司；Cary－Blair半固体培养基购自北京陆桥生物科技公司；Taq酶和DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；厌氧罐、微需氧产气袋购自日本MGC公司；弯曲菌API鉴定条，E－Test药敏试纸条（阿奇霉素、庆大霉素、四环素、环丙沙星、萘啶酸、红霉素、氯霉素、克林霉素），均购自Biomerieux公司；常规试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 用接菌环沾取少量盲肠内容物或棉拭子划线接种到CCDA选择性培养基上，猪盲肠棉拭子直接划线接种到CCDA选择性培养基上，将接菌后的平板置于MGC厌氧罐中，根据厌氧罐容量2.5L／袋标准，放入微需氧产气袋，此时容器内约含二氧化碳5%～10%。随后连同容器一并置于42℃培养箱中培养24h。

1.2.2 分离纯化 将分离培养的疑似菌落转接于TTC琼脂平板、哥伦比亚血平板纯化培养，培养条件同上。

1.2.3 PCR检测方法

1.2.3.1 PCR引物设计 根据GenBank公布的空肠弯曲杆菌16SrRNA基因序列的保守片段，设计引 物 序 列 如 下：正 向 引 物 F：5′－CATCTTCCCTAGTCAAGCCT－3′，反 向 引 物 R：5′－AAGATATGGCACTAGCAAGAC－3′。

1.2.3.2 模板DNA的提取 将哥伦比亚平板纯化培养所得的细菌按照煮沸法提取DNA。

1.2.3.3 PCR 反应体系 PCR 反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，Taq DNA 聚合酶（5U／μL）0.5μL，dNTP（2.5mmol／L）0.5μL，上下游引物（20pmol／μL）各0.5μL，模板DNA 1μL，无菌去离子水加至25μL。

1.2.3.4 PCR 扩 增 条 件 94 ℃ 5min；94℃1min，64℃1min，72℃1min；94℃1min，62℃1min，72℃1min；94℃1min，60℃1min，72℃1min；94℃1min，58℃1min，72℃1min；94℃1min，56℃1min，72℃1min，以上5个梯度各2个循环；94℃1min，54℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR产物用15g／L琼脂糖凝胶电泳，电泳后在凝胶成像系统中观察、拍照。

1.2.4 菌种的保存 经PCR及测序鉴定为空肠弯曲杆菌阳性菌株收集，置于含7%DMSO的MH肉汤中，置－80℃冷冻保存。

1.2.5 空肠弯曲杆菌的耐药性检测分析 根据临床用药情况和对公共卫生的影响选择6类8种抗菌药物，按照美国临床实验室标准化协会（CLSI）的标准，用E－Test药敏试纸条检测所有菌株对这6类8种抗菌药物的最低抑菌浓度。6类8种抗菌药物分别是大环内酯类（阿奇霉素、红霉素）；喹诺酮类（萘啶酸、环丙沙星）；氨基糖苷类（庆大霉素）；四环素类（四环素）；酰胺醇类（氯霉素）；林可霉素类（克林霉素）。对保存的38株空肠弯曲杆菌菌株根据E－Test测试条说明书进行药敏试验。

2 结果

2.1 细菌分离

空肠弯曲杆菌在CCDA选择性培养基上生长出较小的圆形光滑、灰色闪金属光菌落，有时沿接种线向外扩散或容易连成串珠状。经涂片革兰染色为革兰阴性菌，形状颇似逗点。

2.2 PCR试验结果

电泳结果显示，该PCR方法对空肠弯曲杆菌能扩增出特异性片段。通过凝胶成像系统对该特异片段进行迁移率计算，计算其大小为773bp。电泳结果见图1。

2.3 细菌分离鉴定结果

共采集样品170份，分离得到空肠弯曲杆菌38株，平均感染空肠弯曲杆菌阳性率为16.89%。其中，鸡源样品120份，其感染阳性率为18.33%，分离到22株空肠弯曲杆菌；猪源样品50份，其感染阳性率为32%，分离到16株空肠弯曲杆菌。

图1 PCR鉴定电泳结果Fig.1 Electrophoresis of PCR identification results

2.4 空肠弯曲杆菌药敏试验结果

22株鸡源空肠弯曲杆菌分离菌株对8种抗生素存在不同程度的耐药性，大多数菌株对阿奇霉素、四环素、萘啶酸和克林霉素耐药。对红霉素耐药率最高，达到100%，不到50%的菌株对环丙沙星、氯霉素耐药，对庆大霉素较为敏感，敏感性可达80%以上（表1）。16株猪源空肠弯曲杆菌分离株对红霉素耐药率达到90%以上，对庆大霉素、四环素、萘啶酸耐药率超过50%，对阿奇霉素、克林霉素较为敏感（表2）。

3 讨论

本试验所采集的不同来源样本均来自同一地区，但其分离率有一定差异，猪源分离率高于鸡源分离率，很可能与养殖方式有关。目前，该地区鸡的规模化养殖较为普遍，而猪还是以小规模散养为主，其饲养水平、饲养条件和卫生状况较规模化养殖还有一定差距，导致猪的带菌水平较高。

药物敏感性试验结果表明，鸡源和猪源空肠弯曲杆菌大多数对红霉素、四环素、萘啶酸耐药，且都对红霉素耐药率最高，这可能与畜禽养殖中使用的饲料添加剂有关。鸡源和猪源空肠弯曲杆菌对敏感药物种类有较大区别，这可能与药物的经验临床使用、用药的频率、强度有关。

表1 鸡源22株空肠弯曲杆菌分离株药敏感性检测结果Table 1 The detecting results of antimicrobial susceptibility of 22 C.jejuni strains from chickens

表2 猪源16株空肠弯曲杆菌分离株药敏感性检测结果Table 2 The detecting results of antimicrobial susceptibility of 16 C.jejuni strains from swine

本试验分离的空肠弯曲杆菌几乎对所有抗菌药物都有不同程度的耐药，其耐药性的出现给临床及兽医用药带来了问题，更重要的是其耐药性可通过食物链传播，对动物尤其是人类的食品安全造成严重危害。针对目前细菌耐药性逐渐增强的趋势，一方面国家应对抗生素的使用或添加制定更严格统一的限量标准，减少同一种药物的使用频率，严格进行合理用药；另一方面，应从动物饲养的源头抓起，鼓励和发展集约化养殖，减少散户养殖，加强饲料安全检测，改善饲养和防疫条件，规范用药，降低细菌耐药性，保障动物产品安全，维护人类健康［11］。

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［9］ 阳成波，蒋原，黄克和.空肠弯曲杆菌感染流行病学研究进展［J］.动物医学进展，2002，23（6）：10－13.

［10］ 孙长贵，译.NCCLS抗微生物药物敏感性试验执行标准抗微生物药物敏感性试验执行标准［S］.2006版，第十六版信息增刊.

［11］ 娜仁高娃，陈 霞，吴聪明.鸡源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的临床分离及多重PCR鉴定［J］.中国兽医杂志，2010，46（1）：38－39.