肉鸽大肠埃希菌和沙门菌混合感染的诊断

吕敏娜，孙铭飞，蔡瑞权，戚南山，廖申权，吴彩艳，李 娟，沈浩铎

（1.广东省农业科学院动物卫生研究所 广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州510640；2.潮州市枫溪区动物防疫监督所，广东潮州521000；3.潮州市农业科技发展中心，广东潮州521000）

近年来，广东省养鸽业发展迅速，已经成为继养鸡、养鸭、养鹅业之后的最大的养禽业，养殖模式也由以前的散养型转变成高度的集约化型。大肠埃希菌（Escherichia coli）和沙门菌（Salmonella）是危害养鸽业的两大重要细菌性病原［1］。大肠杆菌病和沙门菌病同为条件性致病菌，当动物机体防御机能下降、饲养管理不当、环境变化以及应激因素影响时，都可能导致有该两种或单一种病原菌造成的疾病的发生与流行［2］。鸽场发生大肠埃希菌和沙门菌混合感染时，发病率、病死率更高，给养鸽业造成更为严重的经济损失。

广东省粤东地区某肉鸽场，幼鸽出壳后7d开始发病死亡，临床症状表现为精神沉郁、厌食、拉灰白色稀粪，剖检可见肝脏有点状坏死，十二指肠黏膜充血、出血，输尿管尿酸盐沉积，死亡率达10%，用青、链霉素治疗见效，但停药后几天又复发，如此反复。为鉴定病原，本文进行以下研究。

1 材料与方法

1.1 材料

广东省粤东地区某肉鸽场病死的10日龄幼鸽，采集其肝脏和心血各30份用于病原的分离。

肠杆菌科细菌生化常规鉴定试剂盒、沙门菌生化常规鉴定试剂盒、麦康凯琼脂、SS琼脂、沙门菌显色培养基为广东环凯微生物科技有限公司产品；药敏试纸、革兰染色液为杭州天和微生物试剂有限公司产品；E.coli DH5α、琼脂糖为 Promega公司产品；pMD－18TVector、DNA Marker （DL2000）、Premix Taq为宝生物工程（大连）有限公司产品；胶回收试剂盒为Omega生物科技公司产品。根据GenBank中大肠埃希菌和沙门菌16SrRNA基因序列，分别设计扩增大肠埃希菌16SrRNA基因引物：E－16F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′，E－16R：5′－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3′；设计扩 增 沙 门菌 16SrRNA 基因引物：Sal－16F：5′－TGAGAGTT－TGATCCTGGCTC－3′，Sal－16R：5′－TAGGGATACCTTGTTACGAC－3′。引 物 由 上 海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 无菌采病死幼鸽的心血、肝脏各30份，分别接种麦康凯琼脂培养基，于37℃培养24h～48h，将麦康凯琼脂培养基上的两种不同颜色菌落，红色菌落（疑为大肠埃希菌）编号为A菌株，无色菌落（疑为沙门菌）编号为B菌株。将A菌株、B菌株分别转接SS琼脂培养基、沙门菌显色培养基，37℃培养18h～24h。

1.2.2 细菌形态观察 取麦康凯琼脂培养基上的A菌株、B菌株，按常规方法进行涂片，革兰染色，镜检观察形态结构及染色特性。

1.2.3 生化试验 取麦康凯琼脂培养基上A菌株、B菌株的单个菌落分别接种生化反应管，A菌株接种肠杆菌科细菌生化常规鉴定盒中系列反应管，B菌株接种沙门菌生化常规鉴定盒中系列反应管，具体操作均按产品使用说明书的操作步骤进行，置于37℃培养箱中培养，并按规定时间判断结果。

1.2.4 动物回归试验 将经纯化培养的A菌株、B菌株，用灭菌生理盐水稀释为1.2×109cfu／mL的菌液，选用10d黄鸡及12d鸭各30只，各随机分成3组，分别为A菌株、B菌株试验组和空白对照组，试验组腿部肌肉注射菌液1mL／只，空白对照组注射生理盐水1mL／只。观察其发病和死亡情况，剖检观察病变，进行细菌分离，对新分离的细菌进行菌落形态对比及生化试验。

1.2.5 药敏试验 采用药敏纸片扩散（KB）法［3］，将分离的A菌株、B菌株的纯培养物均匀涂布于麦康凯琼脂平板，贴上药敏试纸，37℃培养22h，观察判定结果。

1.2.6 分离A菌株、B菌株16SrRNA基因的克隆及序列分析 取A菌株、B菌株的细菌菌落1个～2个悬浮于50μL TE缓冲液中（10mmol／L Tris－Cl，1mmol／L EDTA，pH 8.0），100°C 加 热 10 min，12 000r／min离心3min，取上清分别作为 A菌株、B菌株DNA模板［4］。分别用16SrRNA引物进行PCR扩增A菌株、B菌株的16SrRNA基因，A菌株的PCR反应程序为：94℃4min；94℃30s、55℃ 1min、72℃ 2min，30个循环；72℃ 10 min。B菌株的PCR反应程序为：95℃5min；94℃1min、55°C 1min、72℃ 2min，30个循环；72℃8min。PCR产物进行10g／L琼脂凝胶电泳，回收的目的片段与pMD－18TVector连接，分别参照各试剂盒使用说明操作。连接产物转化大肠埃希菌DH5α，阳性克隆的筛选按照文献［5］进行。重组质粒由上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果经Blast进行序列比较，同源序列分析，并绘制遗传进化树。

2 结果

2.1 细菌培养结果

从病死幼鸽分离到的疑似大肠埃希菌A菌株在麦康凯琼脂培养基上生长为边缘整齐、隆起、表面光滑湿润的圆形红色菌落，在SS琼脂上长成红色菌落，在沙门菌显色培养基上长成蓝绿色菌落（图1）。而疑似沙门菌的B菌株在麦康凯琼脂培养基上生长为边缘整齐、稍隆起、表面光滑湿润的圆形无色菌落，在SS琼脂上长成无色且中央有小黑点的菌落，在沙门菌显色培养基上长成品红色菌落（图1）。

图1 细菌培养结果Fig.1 The results of bacterial culture

2.2 细菌的形态观察

A菌株革兰染色呈阴性，两端钝圆的短杆菌，判定为疑似大肠埃希菌。B菌株革兰染色呈阴性，中等大小的杆菌，判定为疑似沙门菌。

2.3 生化鉴定结果

A菌株接种肠杆菌科细菌，生化常规鉴定试剂盒生化反应结果符合肠杆菌科细菌特征（表1）。

表1 A菌株生化试验结果Table 1 Biochemical test results of bacterial isolate A

B菌株接种沙门菌生化常规鉴定试剂盒生化反应结果符合沙门菌生化鉴定特征（表2）。

2.4 回归动物试验结果

A菌株以1.2×109cfu／只的剂量感染10日龄黄鸡及12日龄鸭，黄鸡在感染后22h开始出现临床症状，24h开始出现死亡，鸭在感染后30h开始出现死亡，两者均拉白色稀粪。剖检24h～48h死亡的病例，36h后死亡的病例可见明显的心包炎、肝周炎。96h后均不再出现死亡，且存活2只鸡、2只鸭逐步恢复精神、食欲，而空白对照组鸡、鸭在试验期间精神状态、食欲均无异常变化，从死亡病例中分离的细菌，镜检、生化试验结果，其生物学特性与攻毒A菌株相同（表3）。

表2 B菌株生化试验结果Table 2 Biochemical test results of bacterial isolate B

表3 A菌株动物回归试验Table 3 Animal regression test of bacterial isolate A

B菌株以1.2×109cfu／只的剂量感染10d黄鸡及12d鸭，黄鸡在感染后66h开始出现临床症状并死亡，而鸭在感染后44h开始出现死亡，两者均拉白色稀粪。剖检病死病例，均可见明显的心包炎，输尿管有尿酸盐沉积。96h后均不再出现死亡，且存活4只鸡、2只鸭逐步恢复精神、食欲，而空白对照组鸡、鸭精神状态、食欲均无异常状况，从死亡病例中分离的细菌，镜检、生化试验结果，其生物学特性与攻毒B菌株相同（表4）。

表4 B菌株动物回归试验Table 4 Animal regression test of bacterial isolate B

2.5 药敏试验结果

A菌株对头孢唑啉、头孢拉定、氨苄西林／舒巴坦、阿莫西林高度敏感，对链霉素、阿米卡星、头孢噻吩、壮观霉素中度敏感，对利福平、氧氟沙星、阿奇霉素低度敏感，对氨苄西林、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、四环素、红霉素、林可霉素、复方新诺明、万古霉素、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、克拉霉素、罗红霉素、恩诺沙星不敏感。

B菌株对头孢唑啉、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素、新霉素、头孢噻吩、诺氟沙星、恩诺沙星、壮观霉素、头孢拉定、氧氟沙星、环丙沙星、阿莫西林、洛美沙星、氨苄西林／舒巴坦高度敏感，对氨苄西林、链霉素、强力霉素、阿奇霉素中度敏感，对复方新诺明低度敏感，对利福平、四环素、红霉素、林可霉素、万古霉素、克拉霉素、罗红霉素不敏感。

2.6 PCR扩增结果及进化关系比较

以A菌株、B菌株DNA为模板，用16SrRNA引物E－16F／E－16R、Sal－16F／Sal－16R分别进行PCR扩增，各自扩增出约1.5kb的DNA片段（图2）。

PCR产物经电泳回收后与pMD－18TVector连接，转化DH5α，挑选阳性克隆测序，结果显示A菌株16SrRNA长度约为1 494bp、B菌株约为1 508bp。与GenBank数据库中16SrRNA序列进行相似性比较分析，A菌株与E.coli16SrRNA基因序列同源性达99%；B菌株与GenBank中沙门菌16SrRNA基因序列同源性也可达99%以上。分别构建系统发育树，结果可见A菌株与E.coliAB45分离株处于同一进化分支上，而B菌株与S.enterica分离株进化关系最近（图3、图4），判定A菌株为大肠埃希菌，B菌株为沙门菌。

图2 16SrRNA基因PCR扩增Fig.2 16SrRNA gene amplification by PCR

图3 A菌株16SrRNA基因序列的系统进化树Fig.3 Phylogentic analysis of isolate A 16SrRNA

图4 B菌株16SrRNA基因序列的系统进化树Fig.4 Phylogentic analysis of isolate B 16SrRNA

3 讨论

根据临床症状、剖检病变、细菌分离培养、染色镜检、生化试验以及16SrRNA基因序列分析，确认从广东省粤东地区某肉鸽场分离到的A菌株为大肠埃希菌，B菌株为沙门菌。再者，血凝试验不凝集红细胞，排除新城疫病毒及禽流感病毒感染，所以该鸽场的肉鸽发病是由大肠埃希菌与沙门菌混合感染引起。从动物回归试验结果可知A菌株、B菌株均可对雏鸡、雏鸭致病、致死。药敏试验结果显示，供试的27种抗菌药，大肠埃希菌只对4种药物高度敏感，对5种药物中度敏感，对其余19种药物低敏或不敏感；而沙门菌对15种药物高度敏感，对4种药物中度敏感，对其余8种药物低敏或不敏感，根据此结果，筛选敏感药物投药，治疗效果明显。

大肠埃希菌和沙门菌可存在于饲料、饮水、灰尘等，据研究鸽舍灰尘中大肠埃希菌含量可达105个／g～106个／g［6］。当冬季为保温而封闭饲养时，会造成通风不良，同时鸽子饲喂时往往拍飞而产生浮尘，因此，加强饲养管理，保持鸽舍卫生清洁，合理通风，采取措施减少与降低浮尘，可有效预防大肠杆菌病和沙门菌病。大肠埃希菌与沙门菌血清型多［7］，且不同菌株之间不产生交叉保护作用，因此采用分离菌株制备自家苗进行预防接种是防治疾病可行且有效的方法。另外，由于大肠埃希菌与沙门菌对抗生素容易产生耐药性、多重耐药现象严重，尤其是大肠埃希菌和沙门菌混合感染的病例［8－9］。所以通过实验室对致病性细菌进行分离鉴定和药敏试验，为临床用药提供依据，防止盲目用药，是提高经济效益，减少耐药性的有效方法。

16SrRNA基因为所有细菌共有，以其在进化上的特征性序列，现已被广泛用于细菌分类和鉴定的分子指标［10］。细菌16SrRNA基因由可变区和保守区交替组成，保守区在所有细菌中高度一致，而可变区则因菌种的不同而有较大的变化［11－12］。所以，16SrRNA既可作为细菌分类的标志，又可作为临床病原菌检测和鉴定的靶分子。李永锋等［13］根据Matsuki的研究，提出16SrRNA序列的同源性大于97%，便可认为是同一种。本试验结果，A菌株与GenBank数据库中E.coli 16SrRNA基因序列同源性达99%；B菌株与GenBank中沙门菌16S rRNA基因序列同源性也可达99%以上，因此A菌株判定为大肠埃希菌，B菌株判定为沙门菌。

参与文献：

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