褪黑素对阿尔茨海默病样细胞总tau蛋白表达的影响

吴敏霞 谢捷明 周琳瑛 (福建医科大学基础医学院病理学系电镜室，福建 福州 350004)

正常生理条件下，大脑中tau蛋白存在于神经元的轴突中，可促进微管蛋白聚集成微管并增强其稳定性、维持细胞的生长发育，且在神经系统的形成和轴突的通讯传导中起着至关重要的作用〔1〕。褪黑素(MLT)为体内松果体分泌的一种神经内分泌激素，化学结构为 N-乙酰-5-甲氧基色胺，现可人工合成。MLT具有某些重要的神经精神作用，如抗衰老、催眠、镇痛、抗癫痫、脑细胞损伤保护等作用。在AD患者，tau蛋白被异常过度磷酸化。课题组前期的研究也证明OA作用于NG108-15细胞导致细胞Ser-396位点磷酸化tau蛋白表达增高，与AD病人脑组织中的病理特征一致，可作为研究AD的细胞模型〔2〕。在此基础上，本实验用细胞免疫化学及细胞免疫印迹技术观察MLT对此AD样细胞总tau蛋白水平的影响，进而明确褪黑素对AD样细胞的拮抗作用，对其机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 冈田酸(OA)为Sigma公司产品，用DMSO配成20 μmol/L的母液，分装备用。鼠抗tau蛋白单克隆抗体(Tau-5)，Neomarkers公司产品。Marker，Fermentas公司产品。大鼠神经母细胞和小鼠胶质细胞瘤细胞的杂交细胞系NG108-15细胞。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NG108-15细胞用含15%胎牛血清的1640培养液，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，待细胞间隙变得较明显，细胞突起有所回收时终止消化，1640培养液吹打成单个细胞悬液，3～4 d传代一次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 免疫细胞化学染色 利用总tau蛋白的抗体(Tau-5)，采用免疫细胞化学技术(ABC方法)显示总tau蛋白在细胞内的表达。

1.2.3 Western印迹法 细胞匀浆制备:将种在6孔板上的细胞，每孔加入细胞裂解液60 μl，裂解20 min，用自制的刮匙刮下，于4℃，离心10 min，吸取上清蛋白，用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。

1.2.4 蛋白条带密度分析法 采用ImageMaster®VDS凝胶成像及分析系统，于可见光下采集膜上的蛋白条带图像，通过与标准条带密度相比较，计算各条带密度相对值。

2 结果

2.1 免疫细胞化学染色法 见图1，OA 10 nmol/L作用于NG108-15细胞6 h，加入MLT预处理，MLT浓度为100 μmol/L，提前1 h作用。实验结果表明MLT处理组较模型组细胞总tau蛋白表达增高，主要表现为神经元胞浆和轴突的染色与对照组相比明显变浓，提示MLT可增高AD样细胞总tau蛋白水平。

图1 MLT对NG108-15拟AD样细胞总tau蛋白表达的影响(DAB，×400)

图2 MLT对NG108-15拟AD样细胞总tau蛋白表达的影响

2.2 细胞免疫印迹 图2实验结果显示MLT各处理组细胞总tau蛋白表达增强，提示MLT可明显提高细胞总tau蛋白的表达。与模型组比较，低剂量MLT处理组细胞tau蛋白总水平表达明显增加。结合条带密度分析法，模型组、低剂量MLT处理组、高剂量MLT处理组各条带密度值分别为0.012±0.008，0.085±0.013(P＜0.01)，0.074±0.008(P＜0.01)，低剂量与高剂量MLT处理组差别无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

AD病是由多种因素引起的一种病理过程，神经元纤维缠结(NFT)是其典型的组织病理学改变。NFT由成对螺旋丝(PHF)组成，PHF的主要是由异常磷酸化tau蛋白的微管结合区的自我结合所导致的。

AD脑内的神经元的蛋白激酶系统和磷酸酯酶系统之间的失衡被认为是tau蛋白过度磷酸化的原因。OA是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化。NG108-15细胞系，它是小鼠成神经细胞瘤和大鼠神经胶质瘤的融合杂种系，朱粹青等〔3〕用OA诱导 NG108-15细胞，发现NG108-15细胞发生了tau蛋白的过度磷酸化。课题组前期的研究也证明OA作用于NG108-15细胞导致细胞ser-396位点tau蛋白过度磷酸化，与AD病人脑组织中的病理特征一致，可作为研究AD的细胞模型〔2〕。

细胞内总tau蛋白包括磷酸化tau蛋白和非磷酸化tau蛋白，本实验研究结果显示，MLT使模型组细胞总tau蛋白水平明显提高，前期研究显示 MLT使其磷酸化tau蛋白水平降低〔2〕，推论出MLT能增高AD样细胞非磷酸化tau蛋白水平，表明MLT能通过提高非过度磷酸化tau蛋白的表达来维持tau蛋白的正常功能，促进微管组装与维持正常轴浆流，保证神经元功能的正常运行;本文结果说明MLT对总tau蛋白的作用与剂量不成比例。

在AD细胞模型中，用MTL进行预处理，研究总tau蛋白和磷酸化tau蛋白表达的变化，可以推断出非磷酸化tau蛋白的量的变化，明确该药物的拮抗作用。在此基础上，研究tau基因等多种基因的表达与变化，可进一步在基因水平上探讨其发病机制和MLT的拮抗途径，也能为筛选抗AD的其他药物研究提供参考依据。

1 吴 琪.Alzheimer病神经原纤维缠结tau蛋白研究〔J〕.中国神经精神疾病杂志，2000;26(1):63-4.

2 吴敏霞，许 盈，谢捷明，等.褪黑素对冈田酸致NG108-15细胞tau蛋白过度磷酸化的影响〔J〕.福建医科大学学报，2006;40(4):338-40.

3 朱粹青，曹小定.调心方药物血清对动物阿尔茨海默病相关的tau蛋白磷酸化的调节作用〔J〕.中国中西医结合杂志，2001;21(11):834-6.