肉桂醛与盐酸小檗碱联合氟康唑抗白念珠菌作用的体外实验观察＊

谭 心，王 和，苑天红，马 妍

(1.贵州省遵义市第一人民医院检验科，贵州遵义 563002;2.贵阳医学院生物学教研室，贵州贵阳 550004)

近年来，随着抗菌药物、免疫抑制剂和激素在临床上大量应用，真菌感染率持续升高，其中白念珠菌是院内感染的主要致病菌之一［1－2］。氟康唑是目前国内治疗白念珠菌感染的常用药物之一，由于在临床上长期应用，耐药菌株不断产生，白念珠菌对氟康唑的耐药问题日渐凸显［3］。研究表明，中药中大量结构新颖、药理活性强的化合物，在抗真菌感染中具有一定的优势［4－5］。目前，联合应用抗真菌药物来避免耐药性产生和减少药物副作用是治疗真菌感染的研究方向之一［6］。本研究将通过探讨肉桂醛、盐酸小檗碱和氟康唑单独及其联合抗白念珠菌的作用及其机制，为临床上应用中药及中、西药物联合治疗白念珠菌感染提供初步试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和器材 白念珠菌(ATCC10231)，二甲基亚砜(北京，索莱宝科技有限公司)，RNA-pure Yeast Kit酵母RNA提取试剂盒(北京，康为世纪生物科技有限公司)，RNA逆转录和扩增试剂盒(大连，宝生物工程有限公司)，扩增引物(上海，生工生物工程有限公司)，肉桂醛、盐酸小檗碱(陕西，慈缘生物技术有限公司，批号 CY111220和CY111215);氟康唑(江西，回音必集团东亚制药有限公司，批号:2011041122)。

1.2 方法

1.2.1 药液配制 将肉桂醛(Cinnamic aldehyde，CIN)、盐酸小檗碱(Berberine Hydrochloride，BER)用二甲基亚砜(DMSO)分别溶解后得到母液的浓度为:12 800 μg/mL 和 25 600 μg/mL、氟康唑(Fluconazole，FLC)用三蒸水溶解后浓度为:1 280 μg/mL的母液，经0.22 μm滤器过滤，－20℃保存备用。

1.2.2 菌液配置 取－80℃冻存的白念珠菌ATCC10231菌种100 μL菌液，滴于SDA培养基上，用涂玻棒，将菌液均匀铺于培养基。37℃恒温培养箱内10 min后，将培养皿倒置并继续培养24 h。连续画线接种于新培养基上，37℃培养24 h。直径＞1 mm的菌落(5个单菌落)置于生理盐水中，用RPMI1640培养基稀释菌浓度:5×104CFU/mL。

1.2.3 3 种药物的药敏试验

1.2.3.1 单药的最低抑菌浓度(MIC)测定［7］参照美国临床与实验标准协会(NCCLS)的真菌药物敏感性试验(M27－A)方案的微量稀释法步骤操作:将肉桂醛、盐酸小檗碱、氟康唑分别用 RPMI1640培养基倍比稀释，其终浓度范围分别为:肉桂醛、盐酸小檗碱为1 280～2.5 μg/mL，氟康唑分别为128～0.25 μg/mL。加入96孔板中，每孔100 μL药液+100 μL含菌培养液。同时设立对照组。每次实验，均设立一组质控菌。经37℃培养48 h，观察结果。每组设3个复孔，试验重复5次。

1.2.3.2 联合药敏试验［8－9］采用棋盘微量稀释法检测，在96孔板上，将肉桂醛、盐酸小檗碱、氟康唑药物原液分别用RPMI1640培养基倍比稀释，使肉桂醛、盐酸小檗碱、氟康唑的终浓度为单用时测得该种菌株 MIC 值的 1/8、1/4、1/2、1、2、4 倍浓度。按照棋盘格法的设计方式，以纵、横两个方向，将不同浓度的两种联用药物各50 μL加入96孔板中，每孔再加入100 μL配制好的菌悬液，分别混合后进行药物联合作用。同时设阳性对照孔(100 μL含菌培养液+100 μL无药培养液)及阴性对照孔(无菌无药的培养基200 μL)，混匀。真菌培养步骤和药物处理时间同上(2.3.1)。

1.2.3.3 药物单独及联合作用评价［10］FIC 为两药物联合抗菌时，其中单药所需最低抑菌浓度(MIC)与药物单用时抗菌的 MIC比值(FIC=MIC甲药联用/MIC甲药单用);FICI为两种药物 FIC 之和(FIC=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用)。两药联合作用时评价方式为:当FICI≤0.5时，两药联合抗菌效应为协同作用;当0.5＜FICI≤1时，两药联合抗菌效应为累加作用;当1＜FICI≤2时，两药联合抗菌效应为无关;FICI＞2时，两药的相互作用为拮抗作用。

1.2.4 3种药物的单独及联合对白念珠菌PLB1 mRNA表达水平的影响:实验设对照组、试验组:CIN 80 μg/mL、BER 20 μg/mL、FLC 4 μg/mL、CIN 320 μg/mL、BER 80 μg/mL、FLC 16 μg/mL、CIN 80 μg/mL 与 FLC 4 μg/mL、BER 20 μg/mL 与 FLC 4 μg/mL。经37℃培养6～8 h后，按照 RNApure Yeast Kit酵母RNA提取试剂盒操作方法，提取各组总RNA，测定总RNA浓度和纯度，在紫外透射仪上观察，并扫描凝胶，检测总RNA的完整性，进行逆转录及PCR反应。采用凝胶分析软件bandscan4.3对电泳结果分析，得到内参TEF3、目的基因PLB1的灰度值，目的基因mRNA的相对表达量用目的基因与内参基因条带的灰度值的比值来表示。

1.2.5 统计学分析 将每种药物单用及分别联合时MIC值转换成对数后，进行配对资料的t检验(student’s t－test)，P ＜0.05 时具有统计学差异。计量资料以均数±标准差(±s)来表示，首先进行正态性和方差齐性检验，若满足正态性和方差齐性则采用F检验(方差分析)，两两之间比较采用q检验，计数资料进行x2检验，以P≤0.05有统计学意义。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 药物单独及其联合抗白念珠菌药敏实验的结果 药物单独作用于白念珠菌时:肉桂醛、盐酸小檗碱、氟康唑抗白念珠菌的MIC范围分别为:160～320、80 ～160 和 8 ～16 μg/mL，其 MIC80分别为:320、80、16 μg/mL;药物两两联合作用于白念珠菌时，单药MIC值得几何均数均显著减少(见表1):①CIN与FLC:CIN的MIC值几何均数从278.85 μg/mL 降至 91.89 μg/mL(t=8.73，P ＜ 0.001)、FLC的MIC值几何均数从13.92 μg/mL降至4.59 μg/mL(t=13.24，P ＜ 0.001);②BER 与 FLC:BER的 MIC值几何均数从105.56 μg/mL降至22.97 μg/mL(t=11.32，P ＜ 0.001)、FLC 的 MIC值几何均数从12.15 μg/mL降至5.27 μg/mL(t=12.23，P ＜0.001)。

表1 药物联合抗白念珠菌作用效果评价

2.2 药物对白念珠菌酶相关PLB1基因mRNA表达的影响 通过RT－PCR技术，得到内参基因TEF3和PLB1扩增产物分别呈517bp和416bp条带(见图1)，其PLB1基因在mRNA的相对表达量水平分别为(见表 2):0.950、0.903、0.847、0.849、0.794、0.781、0.708、0.536 和 0.364，低于对照组(P ＜0.05)。

表2 药物对白念珠菌酶相关PLB1基因mRNA表达的影响(±s)

表2 药物对白念珠菌酶相关PLB1基因mRNA表达的影响(±s)

注:*表示实验组与对照组比较P＜0.05，表示药物联合组与药物单用组比较，P＜0.05。

组 别 PLB1mRNA 表达水平Control 0.950 ±0.022*CIN 80μg/mL 0.903 ±0.031*BER 20μg/mL 0.847 ±0.018*FLC 4μg/mL 0.849 ±0.021*CIN 320μg/mL 0.794 ±0.019*BER 80μg/mL 0.781 ±0.026*FLC 16μg/mL 0.708 ±0.015*CIN 80μg/mL+BER 20μg/mL 0.631 ±0.020*CIN 80μg/mL+FLC 4μg/mL 0.536 ±0.017*BER 20μg/mL+FLC 4μg/mL 0.364 ±0.025*

图1 各组药物处理白念珠菌后磷脂酶基因PLB1的RT－PCR产物电泳结果

3 讨论

目前研究认为，磷脂酶 B(phospholipase B，Plb)是白念珠菌分泌的、与其致病性密切相关的侵袭性酶［11］。它主要通过分解宿主细胞膜磷脂而引起膜的通透性增高和完整性受损，继而促进白念珠菌的早期入侵，目前认为白念珠菌Plb分为Plb1、Plb2、Plb5 三个亚型［12］，其中 Plbl被认为是最主要的致病因子，它是一种分泌型糖蛋白，同时具有水解酶和溶血磷脂转酰酶的活性，也是白念珠菌致病所必需的毒力因子［13］。

本研究通过肉桂醛、盐酸小檗碱单独及联合氟康唑作用白念珠菌，对白念珠菌PLB1的表达水平进行分析，通过采用RT－PCR方法，检测结果显示:肉桂醛、盐酸小檗碱单独抗菌时，均可降低白念珠菌酶基因PLB1 mRNA的表达量，引起细胞外PL的分泌量降低，当肉桂醛、盐酸小檗碱分别与氟康唑联合抗白念珠菌后，其白念珠菌酶基因PLB1 mRNA的表达量要明显低于药物单用。

药物在协同作用下联合用药时，具有增强杀菌效果、减少药物用量、缩短疗程、同时由于其单药的MIC联值均比单独抗菌时的MIC80值明显降低，对于防治药物的耐药有很好的效果。由于肉桂醛和盐酸小檗碱是中药中的天然活性成分，植物资源丰富，且在长期临床应用中少见不良反应和毒副作用。因此，肉桂醛、盐酸小檗碱联合氟康唑联合应用的协同作用为今后抗真菌治疗提供了新的思路。

［1］Wang H，Kong F，Sorrell T C，et al.Rapid detection of ERG11 gene mutations in clinical Candida albicans isolates with reduced susceptibility to fluconazole by rolling circle amplification and DNA sequencing［J］.BMC Mi-crobiol，2009，14(9):167.

［2］李华信，高春芳，李晓冰，等.医院深部真菌感染900例病原菌分布及耐药性监测［J］.中华医院感染学杂志，2010，20(13):1980 －1983.

［3］唐冰，朱家源，崔颖鹏，等.187株深部感染真菌的菌群分布及耐药性分析［J］.中国热带医学，2007，7(3):407，424.

［4］Ushiki J Y，Hayakawa T，Tadano.Medicinal plants for suppressing soil－ borne plant diseases［J］.Soil Plant Nutr，1996，42(2):423 －426.

［5］Ushiki J.Medicinal plants for suppressing soil－ borne plant diseasesⅡ－Suppressive effect of Geranium pratense L on common scab of potato and idetification of the active compound［J］.Soil Sci Plan Nutr，1998，44(2):157－165.

［6］Mukheree P K，Sheehan D J，Hitchcock CA，et al.Combination treatment of invasive fungal infections［J］.Clin Microbiol Rev，2005，18(1):163 －194.

［7］National Commitee for Clini cal Laboratory Standards.Reference Method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts:approved standard［S］.NCCLS document M －27A.Pennsylvania:NCCLS，1997:1－21.

［8］Zhu W，Filler S G.Interactions of Candida albicans with epithelial cells［J］.Cell Microbiol，2010，12(3):273 －282.

［9］Maesaki S，Kohno S，Kaku M，etc.Effects of antifungal agent combinations administered simμLtaneously and sequentially against Aspergillus fumigatus［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38:2843 －2845.

［10］Sahm D F，washigton J A I I.Antibacterial susceptibility tests:dilution method［M］.6thed.Manual of clinical microbiology，1995:1117.

［11］曹岩，张巨，沙春蕊，等.白念珠菌分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性与其毒力的关系［J］.吉林大学学报:医学版，2007，3(33):483 －487.

［12］刘奇，白丽.白念珠菌磷脂酶B的研究进展［J］.中国热带医学，2008，8(13):1050 －1052.

［13］Ghannoum M A.Potential role of phospholipase in virulence and fungal pathogenesis［J］.Clin Microbiol Rev，2000，13(1):122 －143.