苗药黑骨藤毛细管电泳指纹图谱的建立＊

刘 云，刘新元，朱欣婷

(1.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州遵义 563099;2.遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099;3.遵义医学院基础医学院，贵州遵义 563099)

黑骨藤又名滇杠柳(Periploca forrestii Schlechty)，为萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca Linn.)植物黑龙骨(Periploca forrestii Schltr.)的根或全株。黑骨藤作为一种民间民族药对风湿性关节炎、跌打损伤、月经不调等疾症具有一定疗效［1－2］。目前，已有研究报道了黑骨藤的化学组成成分［3－6］，并对其总黄酮［7］、总皂苷［8］等成分的含量进行了测定，还通过药理研究证实了该药材具有抑制肿瘤细胞生长［5］、强心［9］、抗炎镇痛［10－12］、细胞免疫抑制等作用［13］。黑骨藤药材虽收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准》［14］，但在该标准中仅对其性状、显微以及部分理化鉴别试验进行了描述，缺乏控制黑骨藤质量的有效方法。因此，本实验选用高效毛细管电泳法(High performance capillary electropho-resis，HPCE)对来自不同产地的黑骨藤进行指纹图谱研究，为黑骨藤的质量控制提供初步依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器与试剂 Beckman P/ACE MDQ(配备DAD检测器)毛细管电泳仪，弹性石英毛细管(75 μm×60 cm)(河北省永年光纤厂)，Multifuge X1R台式冷冻离心机(Thermo scientific)，BSA1245－CW型电子分析天平(德国Sartorius公司)，艾柯DZG－303A纯水机，无水乙醇，四硼酸钠，氢氧化钠，盐酸，甲醇。甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

1.2 实验材料 黑骨藤购于不同地区，经遵义师范学院生物系何林副教授鉴定为萝摩科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca Linn)植物黑骨藤的干燥根茎，其来源(见表1)。

表1 黑骨藤的来源

2 方法与结果

2.1 电泳条件 未涂渍弹性石英毛细管(75 μm×60 cm，有效长度60 cm);检测波长:250 nm:进样条件:压力进样 0.5 psi × 5.0 s;电压:15 kv;加压时间:30 min;毛细管温度:20℃;缓冲溶液:50 mmol/L pH=9.36的硼砂缓冲溶液;毛细管使用前依次以0.1 mol/L盐酸，1 mol/L氢氧化钠以及缓冲溶液冲洗4 min、4 min、10 min，期间以超纯水冲洗1 min，并用缓冲溶液加15 kV电压平衡10 min。运行3 h后更换缓冲溶液并重新平衡;进样间以超纯水冲洗1 min;实验结束后以超纯水充满毛细管过夜。

2.2 供试品溶液制备 取黑骨藤粉末(已过40目筛)6 g，置于烧杯中，加入40 mL 85%乙醇，略加热(至25℃即可)，温和搅拌15 h，将提取液以10 000 rpm/min 离心10 min，取上清液过 0.2 μm 滤膜得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 取同一供试品溶液(S 10)，连续进样5次，共有峰的相对保留时间RSD%＜1.04%，共有峰相对峰面积RSD% ＜8.43%。

2.3.2 重现性实验 取同一样品(S 10)，按2.2项所述方法平行制备5份供试品溶液，然后在2.1所述条件下进行分析，共有峰的相对保留时间RSD%＜0.23%，共有峰相对峰面积 RSD% ＜12.07%。

2.3.3 稳定性试验 取同一样品(S 10)，按2.1项所述方法在 0、2、4、8、12、24 h 测定，其共有峰相对保留时间RSD% ＜0.34%，共有峰相对峰面积RSD% ＜6.52%。

2.4 黑骨藤指纹图谱的建立 将10批次(S1－S10)按2.2项所述方法制备的样品溶液分别放入自动进样样品管中，按2.1所述方法分别测定其HPCE谱图。根据测定结果所给出的各批次样品的峰面积及保留时间等有关参数，进行分析比较，确定优化后的指纹图谱(见图1)。

图1 黑骨藤的HPCE指纹图谱

2.5 黑骨藤指纹图谱的分析

2.5.1 共有指纹峰标定:经过对十批次黑骨藤样品的HPCE色谱图分析，标定7个共有峰(编号为1、2、3、4、S、5、6)作为指纹图谱的特征峰。各供试品共有峰相对保留时间和相对峰面积构成了黑骨藤的指纹特征(见表1、2)。

2.5.2 相似度评价 将10批次黑骨藤 HPCE指纹图谱导入“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件，选S7为参照图谱，经多点校正后，将色谱峰自动匹配，生成黑骨藤HPCE指纹谱共有模式图谱(见图2)，并进行相似度计算(见表3)。由表3可知10个批次的黑骨藤相似度在0.760～0.983，差异较大。符合指纹图谱相似度计算结果在0.9 ～1.0的要求。

表1 黑骨藤的HPCE指纹图谱共有峰的相对保留时间

表2 黑骨藤的HPCE指纹图谱共有峰的相对保留峰面积

图2 黑骨藤HPCE指纹图谱共有模式

表3 黑骨藤的HPCE指纹图谱相似度计算结果

2.5.3 指纹图谱的聚类分析 选择黑骨藤的HPCE指纹图谱中7个比较明显的共有峰，根据表2中的数据，用SPSS软件中聚类分析功能对10个批次黑骨藤样品进行聚类分析，所用聚类方法为组间连接(average linkage:between groups)，距离公式为平方欧式距离(square Euclidean distance)，得到10批次黑骨藤样品的聚类分析图(见图3)。由图 3 可见，距离为 1 时，S1、S2、S3、S4、S5、S7、S10归为一类，S8、S9 为归一类;距离为 5 时，S6、S8、S9归为一类;距离为25时，所有批次样品才归为一类。这与实验得出的黑骨藤HPCE指纹图谱共有模式结果相符合。

图3 黑骨藤的HPCE指纹图谱的聚类分析图

2.5.4 疑似样品分析 将其他来源的疑似黑骨藤样品按照2.2项下方法制成供试品后，按2.1项所述方法分别测定其HPCE图谱，结果(见图4)。

图4 疑似黑骨藤样品的HPCE图谱

3 讨论

黑骨藤作为特色苗药，已受到越来越多研究者的关注，但至今其有效成分尚未明确。在黑骨藤有效成分不完全明确的前提下，制定其指纹图谱，对于有效地控制该药材的质量，具有重要意义。由本文实验结果可知，利用高效毛细管电泳方法初步建立的黑骨藤的指纹图谱，其指纹峰的相对保留时间的RSD值小于0.94%，可作为鉴别黑骨藤真伪的一个标准。而黑骨藤指纹峰的相对保留峰面积的RSD值在27.26% ～108.21%，差异较大，这与本次试验所采用样品的产地及采收时间的差异有重要关系。

在实验过程中，我们对内标物、背景缓冲溶液、检测波长以及分离电压的选择进行了考察。①内标物的选择:在目前黑骨藤的药理活性成分或指标成分尚不十分明确的前提下，无法选择合适的对照品或内标物作为参照物指定指纹图谱，因此选择了供试品中峰面积相对较大，出峰时间较稳定的色谱峰代替内标峰，用以计算其它各共有峰指纹峰的相对保留时间及相对保留峰面积［15］。②电泳缓冲溶液的选择:电泳缓冲溶液的性质直接影响了毛细管电泳的多项指标。电泳缓冲液不同的pH值对应不同的电势，对电渗会产生很大影响［16］。电渗直接决定分离时间和分离距离的长短。本实验考察了硼酸溶液、磷酸盐(磷酸二氢钠－磷酸氢二钠混合盐)溶液及硼砂溶液，经试验后选择硼砂溶液作为缓冲溶液。并考察了pH 7.0～9.5的硼砂溶液对分离度的影响，最终选用pH值为9.36为最佳缓冲溶液pH值。③检测波长的选择:实验考察了不同检测波长(195、200、220、235、250、270、290、330、390 nm)对实验结果的影响。结果显示，部分峰的峰面积在低波长时很大，但在250 nm处各个峰均有较强吸收，因此选择250 nm为检测波长。④分离电压的选择:实验考察了分离电压为10、15、20、25 kV时对分离结果的影响。随着分离电压的增大，出现迁移时间缩短、柱效提高的现象。但当分离电压超过20 kV后，柱效反而降低了，这并不利于样品组分的分离。经综合考虑选择分离电压为15 kV。

综上所述，本实验建立的黑骨藤HPCE指纹图谱方法稳定可靠、可满足黑骨藤药材快速鉴定的要求，为进一步建立、完善黑骨藤指纹图谱打下基础，也为黑骨藤的开发利用、质量保证提供了理论依据。

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