鸭空肠液中消化酶粗提纯方法的比较研究

张 莉 赵 峰 严 峰 米宝民 张宏福

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

在体外模拟消化中，模拟消化液的制备一直是核心技术之一。据 Crévieu-Gabriel等［1］报道，从生长猪与肉鸡体内获得的胃蛋白酶在酶学特性上，如针对不同底物的最适pH、消化能力等方面有较大的差异。由此可见，在模拟消化液中，主要消化酶所来源的动物种属与模拟对象的动物种属相一致是提高模拟消化液仿真程度的关键因素之一。因此，寻求一种快速、有效获取动物体内消化酶的方法迫在眉睫。目前，在对动物体内的消化酶提取时，多采用盐析、透析及超滤等方法进行前处理，再根据目的酶蛋白的不同，采用不同型号规格的凝胶层析柱进行过滤，以相应的缓冲液洗脱并收集峰浓度时的消化酶进行提纯，如淀粉酶［2-3］、胰蛋白酶［4-7］、糜蛋白酶［6-7］、脂肪酶［8］等多采用该方法。通过这些方法提纯酶蛋白时，随着步骤的增加酶蛋白的损失提高，活性回收率降低。而且，这些方法获得的酶蛋白的回收率变异较大，不利于消化酶制备的质量控制。因此，探讨一套步骤简单、消化酶回收率高且可重复的肠液消化酶粗提方法对解决体外模拟消化中消化酶的来源非常关键。为此，本研究以鸭为试验动物，在前期已建立了鸭肠道瘘管的安装方法［9-10］，并可实现从鸭体内大量获取空肠液这一主要原材料的基础上，比较硫酸铵沉淀-透析-冻干法和低温浓缩-透析-冻干法获得的鸭空肠液冻干粉剂在主要消化酶活性与回收率、总蛋白浓度与回收率及化学成分含量上的差异。在此基础上，根据粗提纯肠液消化酶粉剂中化学成分的组成，进一步探讨乙醇脱脂后，硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法和低温浓缩-透析-冻干-脱脂法获得的鸭空肠液冻干粉剂在消化酶活性与回收率上的差异，为最终获得鸭空肠液消化酶粉剂的制备方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验鸭及空肠液的制备

选用80只健康、体重基本一致［(3.25±0.5)kg］的18周龄成年北京公鸭，参考鸭的空肠食糜连续采集方法在卵黄囊憩室部位安装瘘管，并进行相应的术后护理［9-10］。术后第4、5、6天试验鸭分别限量饲喂50、100、150 g玉米-豆粕型饲粮(表1)。术后第7天开始，试验鸭自由采食。待术后恢复30 d后，在瘘管出口处的皮脂上缝合一中央有孔的瓶盖(孔正好穿过瘘管)。3 d后，按照赵峰等［9］隔日重复采样的方法于采样日期的09:30—10:30、13:30—14:30、17:30—18:30 通过收集瓶在低温(0～4℃)条件下收集鸭空肠食糜。每次收集后将食糜摇匀，然后全部转移至250 mL离心瓶中，于4℃、1 250×g条件下离心10 min。取上清液装于1 000 mL样品瓶中，-20℃保存备用。整个鸭空肠食糜采集期为4 d，共获得8 L制备好的空肠液。

1.2 试验设计

本试验采用两样本完全随机设计，将制备的8 L鸭空肠液充分混合均匀，随机分成2组，每组4个重复，每个重复1 L肠液。其中第1组采用硫酸铵沉淀-透析-冻干法制备鸭空肠液消化酶粉剂，第2组采用低温浓缩-透析-冻干法制备鸭空肠液消化酶粉剂，比较2种粗提纯方法制备的消化酶粉剂中主要消化酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶)活性与回收率、总蛋白浓度与回收率及化学成分含量的差异。然后在2种粗提纯方法的基础上，对制备的鸭空肠液消化酶粉剂进行乙醇脱脂处理，进一步比较硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法与低温浓缩-透析-冻干-脱脂法制备的消化酶粉剂中主要消化酶活性与回收率、总蛋白浓度与回收率及化学成分含量的差异。

表1 鸭饲粮组成及营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of the diet for ducks %

1.3 鸭空肠液消化酶的粗提纯方法

1.3.1 硫酸铵沉淀-透析-冻干法

依照0℃时的硫酸铵饱和度计算表，配制10 L饱和硫酸铵溶液，并将其pH调节至7.0;配制0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液3 L备用。取冷冻的北京鸭空肠液4 L左右流水下迅速解冻，200目纱布过滤混匀后，用移液器取6 mL原肠液分装于1 mL离心管中，速冻，待测消化酶活性和总蛋白浓度;其余空肠液取4等份各1 000 mL，每份按70%硫酸铵浓度［11］于冰浴下缓慢并不断搅拌加入pH 7.0的饱和硫酸铵溶液2 333 mL，充分搅拌混合，4℃冰箱静置30 min后于4 000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀用少量0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液复溶，并将复溶物无损失地转入已装好透析袋的玻璃透析管中，连接好进出水管道，用蛋白质透析纯化系统透析200 min(其中40 min×2次0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液透析，40 min×3次去离子水透析)，透析结束后用LGJ-4冻干机冷冻干燥制成鸭空肠液消化酶粉剂。

Change and Reconstruction of Khokhnuur Mongolian Food Culture in the Historically

取冷冻的北京鸭空肠液4 L左右于流水下迅速解冻后，经200目纱布过滤，混匀后留取6 mL肠液于1 mL离心管中，速冻，待测消化酶活性与总蛋白浓度。其余肠液取4等分各1 000 mL，倒入LGJ-4冷冻干燥机托盘中，冷冻浓缩体积减少2/3以上，用少量去离子水复溶后，全部倒入已装好透析袋的透析管中，用蛋白质透析纯化系统透析200 min(40 min×5次去离子水透析)。透析后继续用冻干机冷冻干燥制成鸭空肠液消化酶粉剂。

1.3.2 SOP培训法 每月由护士长或培训教师按SOP教材统一培训1次，带教老师及培训学员均必须严格按SOP要求在临床工作中教学及操作，并有护士长及培训教师进行监督。

1.3.2 低温浓缩-透析-冻干法

1.3.3 硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法

由表2可见，从2种方法制备的鸭空肠液消化酶粉剂中消化酶活性的差异看，低温浓缩-透析-冻干法制备的粉剂在胰蛋白酶、糜蛋白酶及淀粉酶的活性上分别比硫酸铵沉淀-透析-冻干法所制备粉剂高27.9%、12.1%和34.8%(P＜0.05)，低温浓缩-透析-冻干法与硫酸铵沉淀-透析-冻干法制备的粉剂在3种消化酶活性的平均变异系数分别为4.3%与5.0%。在消化酶回收率上，低温浓缩-透析-冻干法制备的粉剂在胰蛋白酶、糜蛋白酶及淀粉酶的回收率上分别比硫酸铵沉淀-透析-冻干法所制备粉剂高35.2%、15.3%和34.8%(P＜0.05)，低温浓缩-透析-冻干法与硫酸铵沉淀-透析-冻干法制备的粉剂在3种消化酶回收率的平均变异系数分别为4.9%与8.3%。2种粗提纯方法制备的粉剂在总蛋白浓度上无显著性差异(P＞0.05)，但在总蛋白回收率上，低温浓缩-透析-冻干法显著高于硫酸铵沉淀-透析-冻干法(P＜0.05)。在2种方法制备粉剂的化学成分含量的差异上，低温浓缩-透析-冻干法制备的粉剂在粗蛋白质及粗灰分含量上显著低于硫酸铵沉淀-透析-冻干法(P＜0.05)，而2方法制备的粉剂在粗脂肪含量上无显著性差异(P＞0.05)。

将硫酸铵沉淀-透析-冻干法获得的鸭空肠液消化酶粉剂，每个重复取5 g放入G4玻璃砂芯坩埚中，加入45 mL无水乙醇，自流冲洗，共冲洗3次。结束后用LGJ-4冻干机冷冻干燥制成鸭空肠液消化酶脱脂粉剂。

α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)活性以可溶性淀粉为底物进行测定［12］，淀粉酶活性单位定义为25℃、pH 6.90条件下每分钟释放1μmol麦芽糖所具有的活性;胰蛋白酶活性以对-苯磺酸-L-精氨酸甲酯(TAME)为底物进行测定［13］，胰蛋白酶活性单位定义为25℃、pH 8.10条件下每分钟释放1μmol对-甲苯磺酸-L-精氨酸时所具有的活性;糜蛋白酶活性以苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)为底物进行测定［14］，糜蛋白酶活性单位定义为在25℃、pH 7.80条件下每分钟释放1μmol苯甲酰-L-酪氨酸所具有的活性。

结合表3不同植被恢复模式AWCD的方差分析表明，刺槐+山杏+紫花苜蓿(0.94±0.44)和油松+旱柳+红豆草混交林(0.65±0.38)土壤微生物利用碳源的量显著高于自然恢复（P<0.01），而青海云杉+油松+河北杨和刺槐+油松混交模式下土壤微生物利用碳源的量显著低于自然恢复（P<0.01），即刺槐+山杏+紫花苜蓿混交林土壤微生物代谢活性最强，而刺槐+油松(0.45±0.32)和青海云杉+油松+河北杨混交林(0.26±0.18)相对于自然恢复土壤微生物代谢活性相对较弱。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 主要消化酶活性的测定

1.3.4 低温浓缩-透析-冻干-脱脂法

1.4.2 总蛋白浓度的测定

粗蛋白质、粗灰分及粗脂肪含量分别参照GB/T 6432—1994、GB/T 6438—2007 和 GB/T 6433—2006测定。

采用总蛋白试剂盒(南京建成生物科技有限公司生产)以考马斯亮蓝比色法测定。

1.4.3 化学成分含量的测定

将低温浓缩-透析-冻干法获得的鸭空肠液消化酶粉剂，每个重复取5 g放入G4玻璃砂芯坩埚中，加入45 mL无水乙醇，自流冲洗，共冲洗3次。结束后用LGJ-4冻干机冷冻干燥制成鸭空肠液消化酶脱脂粉剂。

20年后，随着定向刨花板(OSB)的引入该协会再次扩大，20世纪90年代，其范围扩大到其他工程木产品，如胶合木、工字梁和结构复合木材(SCL)。1994年，更名为工程木协会(Engineered Wood Association，APA)。

1.5 数据计算与统计分析

消化酶回收率、总蛋白回收率采用如下公式计算:

试验数据用平均值±标准差表示，采用SAS 9.1.3统计软件对硫酸铵沉淀-透析-冻干法与低温浓缩-透析-冻干法，硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法与低温浓缩-透析-冻干-脱脂法制备的鸭空肠液消化酶粉剂在消化酶活性与回收率、总蛋白浓度与回收率和化学成分含量上分别作两样本的T检验，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 硫酸铵沉淀-透析-冻干法与低温浓缩-透析-冻干法制备鸭空肠液消化酶粉剂的消化酶活性与回收率、总蛋白浓度与回收率及化学成分含量的差异

25分钟，比一顿饭时间都长。浙江桐庐县一大货车停在高速硬路肩上，车身占1/3的行车道，且未设警示牌。交警上前查看，竟然看见驾驶员竟然在用电磁炉炒菜，一会儿还准备加汤涮火锅。

表2 硫酸铵沉淀-透析-冻干法与低温浓缩-透析-冻干法制备鸭空肠液消化酶粉剂的消化酶活性与回收率、总蛋白浓度与回收率及化学成分含量Table 2 Activity and recovery rate of digestive enzyme，concentration and recovery rate of total protein and chemical composition content of duck jejunal digestive enzymes power using(NH4)2SO4-dialysis-freeze dried method or concentration-dialysis-freeze dried method

2.2 低温浓缩-透析-冻干-脱脂法与硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法提取鸭肠液酶粉剂的消化酶活性与回收率、总蛋白浓度与回收率及化学成分含量的比较

在采用低温浓缩-透析-冻干法与硫酸铵沉淀-透析-冻干法制备鸭空肠液消化酶粉剂后，发现粉剂中有明显的油迹，化学成分测定也得出2种提纯方法获得的粉剂粗脂肪含量在6.6%以上(表2)。因此，对上述2种方法制备的粉剂采用无水乙醇脱脂处理，以求降低粉剂中脂肪的含量，提高消化酶的活性，进一步比较2种粗提纯方法的差异。由表3可见，低温浓缩-透析-冻干-脱脂法制备的粉剂在胰蛋白酶和淀粉酶活性上分别比硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法所制备粉剂高7.9%和11.5%(P＜0.05)，而糜蛋白酶的活性差异不显著(P＞0.05)。低温浓缩-透析-冻干-脱脂法与硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法制备的粉剂在3种消化酶活性的平均变异系数分别为3.9%与4.2%。在消化酶回收率上，低温浓缩-透析-冻干-脱脂法制备的粉剂在胰蛋白酶和淀粉酶回收率上分别比硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法所制备粉剂高43.9%和39.4%(P＜0.05)，而糜蛋白酶活性回收率差异不显著(P＞0.05)。低温浓缩-透析-冻干-脱脂法与硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法制备的粉剂中3种消化酶回收率的平均变异系数分别为9.0%与9.9%。2种粗提纯方法制备的粉剂在总蛋白浓度上无显著性差异(P＞0.05)，但在总蛋白回收率上，低温浓缩-透析-冻干-脱脂法显著高于硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法(P＜0.05)。在2种方法制备粉剂的化学成分含量的差异上，低温浓缩-透析-冻干-脱脂法制备的粉剂在粗蛋白质及粗灰分含量上显著低于硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法所制备粉剂(P＜0.05)，而2种方法制备的粉剂在粗脂肪含量上无显著性差异(P＞0.05)。

表3 硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法与低温浓缩-透析-冻干-脱脂法提取鸭空肠液消化酶粉剂的消化酶活性与回收率、总蛋白浓度与回收率及化学成分含量的差异Table 3 Activity and recovery rate of digestive enzyme，concentration and recovery rate of total protein and chemical composition content of duck jejunal digestive enzymes power using(NH4)2SO4-dialysis-freeze dried-defat method or concentration-dialysis-freeze dried-defat method

3 讨论

在蛋白质纯化中，一般采用一定浓度的硫酸铵溶液沉淀目的蛋白质，然后通过透析去除硫酸铵及小分子物质后，干燥得到目的蛋白质的初级提取物。该方法通过沉淀目的蛋白质可以快速地去除溶液中的水分及其他物质。然而，该方法是通过降低蛋白质的溶解度而沉淀蛋白质，其水溶液中仍有一部分溶解的目的蛋白质被丢弃。特别是在肠液消化酶的纯化中，淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的等电点分别处于 4.5 ～4.6［15］、10.1～10.5［7，16］、8.1 ～ 8.6［7，16］，采用中性硫酸铵溶液沉淀酶蛋白时，溶液的pH并不处于各消化酶的等电点，这导致水溶液中目的蛋白质的浓度并不是最低值。因此，采用硫酸铵沉淀酶蛋白需要着重考虑回收率能否接受。

这几年，李敬益和社区同事在处理矛盾纠纷上又想出了新方法。他们在社区范围内发放“彩云社区无忧卡”和“彩云社区民情联系卡”。这两张卡的正面是诉求者的基本信息与诉求内容，背面是社区工作人员的手机号码。

低温浓缩是对冷冻的样品在低温低压条件下，从冻结状态不经过液态直接升华，达到去除部分水分的目的，然后通过透析去除小分子物质后，干燥得到蛋白质的初级提取物。该方法只有在透析过程中去除了低分子质量的物质，而目的蛋白质被留在透析袋中，因此，该方法回收率较为理想，但是低温浓缩过程消耗时间比较长。本试验在硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法与低温浓缩-透析-冻干-脱脂法制备鸭空肠液消化酶粉剂的过程中，在脱脂前处理的差异上，低温浓缩-透析-冻干法制备的鸭空肠液消化酶粉剂在3种消化酶粉剂的活性与回收率上均显著高于硫酸铵沉淀-透析-冻干法。这一结果与硫酸铵在沉淀酶蛋白时，仍有部分酶蛋白溶解在溶液中的现象相对应。硫酸铵沉淀-透析-冻干法制备的鸭空肠液消化酶粉剂在粗灰分与粗蛋白质的含量上显著高于低温浓缩-透析-冻干法，而两者总蛋白浓度接近，这表明，硫酸铵沉淀-透析-冻干法制备的粉剂可能存在硫酸铵的残留。同时，2种方法获得的粉剂在粗灰分的含量上都很高(10%以上)，这可能是由于透析中无机小分子物质去除不理想。脱脂处理后，硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法与低温浓缩-透析-冻干-脱脂法制备粉剂的消化酶活性比脱脂前分别平均提高了34%和17%。这一方面与粉剂中脂肪含量的降低有关;另一方面，由于粉剂中脂肪含量的降低，使得消化酶的水溶性更好，降低了脂肪对消化酶与底物接触的干扰。脱脂后，2种方法的消化酶回收率均有下降，这说明脱脂过程对消化酶可能有部分破坏作用。在鸭空肠液消化酶提取过程中，低温浓缩-透析-冻干-脱脂法制备的粉剂在消化酶活性与回收率均比硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法高，且变异系数比硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法低。因此，低温浓缩-透析-冻干-脱脂法在制备鸭空肠液消化酶粉剂的效率上优于硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法。然而，在粗提纯消化酶粉剂的杂质含量上，硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法与低温浓缩-透析-冻干-脱脂法中总蛋白浓度占有机物的比例为分别为49%与39%，这也表明硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法分离酶蛋白与其他有机物的效果比低温浓缩-透析-冻干-脱脂法好。在进一步的纯化过程中，如粗提纯消化酶粉剂的无机物能被分离，则硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法获得的酶蛋白的纯度及活性将高于低温浓缩-透析-冻干-脱脂法。

4 结论

①低温浓缩-透析-冻干法制备的消化酶粉剂中，淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性与回收率均显著高于硫酸铵沉淀-透析-冻干法。

②低温浓缩-透析-冻干-脱脂法在淀粉酶、胰蛋白酶活性与回收率均显著高于硫酸铵沉淀-透析-冻干-脱脂法，而在糜蛋白酶的活性与回收率上2种方法间差异不显著。

教学中把培养和发展学生的应用能力放在首位，抓住课程教学的四要素，即从教学目标、教学内容、教学方法和评价方法等方面进行课程教学模式改革，实现教师的教学观念、方法和学生的学习观念、方法的转变.

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