应用体外发酵法研究高精料饲粮NSC/NDF与甲烷产量之间的关系

郑文思 赵广永 张婷婷 牛文静 董瑞兰

(中国农业大学动物科技学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

反刍动物的瘤胃中生活着大量微生物，能够发酵饲料中的碳水化合物，产生挥发性脂肪酸(VFA)、甲烷(CH4)、二氧化碳(CO2)和氢气(H2)。瘤胃内的CH4主要是由产甲烷菌利用CO2和H2合成的［1］。瘤胃内CH4的产生一方面造成饲料能量损失;另一方面还会加重地球温室效应。据联合国粮食和农业组织2006年的统计，家畜产生的温室气体占地球温室气体排放量的18%，而其中73%来自反刍动物。反刍动物瘤胃发酵过程中产生的CH4占反刍动物CH4总产量的90%［2］。准确预测反刍动物的CH4产量是降低瘤胃CH4排放的基础。

饲粮营养水平对瘤胃CH4产量具有重要影响。据报道，饲粮干物质采食量(dry matter intake，DMI)［3-5］、能量消化率［6］、非纤维碳水化合物(non-fibre carbohydrate，NFC)、半纤维素和纤维素(cellulose，C)［7］、可消化粗蛋白质(digestible crude protein，DCP)、可消化粗脂肪(digestible ether extract，DEE)、可消化粗纤维(digestible crude fiber，DCF)和可消化无氮浸出物［5］以及代谢能采食量(metabolizable energy intake，MEI)和饲草比例［3］均与反刍动物CH4产量之间均存在显著的相关关系。但是，在生产实际中，应用饲粮的营养成分或反刍动物的营养物质采食量预测瘤胃CH4产量并不十分方便。

饲粮精粗比是反映反刍动物饲粮特性的重要指标。一些研究表明，饲粮精粗比对瘤胃CH4产量有显著影响。韩继福等［8］研究结果表明，随着饲粮精料比例(concentrate ratio，CR)的提高，肉牛单位代谢体重的CH4产量下降。Chandramoni等［9］研究结果表明，随着饲粮精料比例提高，绵羊的CH4产量下降。精料比例越高，通过CH4损失的饲料能量比例越低［10］。反刍动物饲粮的精料比例一般不高于50%，但在肉牛快速育肥阶段，为了加快肉牛的脂肪沉积，提高牛肉嫩度，在高强度育肥条件下，肉牛饲粮的精料比例可达80%～100%［11］。

饲料中的结构性碳水化合物(structural carbohydrates，SC)主要包括中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)，非结构性碳水化合物(nonstructural carbohydrates，NSC)主要包括淀粉、可溶性糖和果胶。因此饲粮NSC/NDF可被认为是更为准确的日粮精粗比。本试验拟研究高精料条件下，肉牛饲粮NSC/NDF与体外发酵CH4产量之间的关系，阐明根据饲粮NSC/NDF与CH4产量之间关系预测瘤胃内CH4产量的可能性和准确性。

1 材料与方法

1.1 试验动物

以2头年龄为2.5岁、体重约为600 kg，装有永久性瘤胃瘘管的西门塔尔去势公牛作为瘤胃液供体，拴系饲养。瘤胃液供体牛的日粮组成为:精料 2.0 kg，羊草(Chinese wildrye，CW)6.0 kg。其中精料组成为:玉米58%、豆粕20%、麦麸(wheat bran，WB)18%、磷酸氢钙2%、食盐1%、预混料1%。每天07:00和17:00分2次饲喂，自由饮水。

1.2 试验饲粮和试验设计

应用13种肉牛常用饲料为原料，包括精料玉米、豆粕、麦麸、棉籽粕(cottonseed meal，CM)、菜籽粕(rapeseed meal，RM)、次粉(wheat middling，WM)和粗料干酒糟及其可溶物(DDGS)、稻草(rice straw，RS)、麦秸(wheat straw，WS)、玉米秸(corn stover，CS)、谷草(millet straw，MS)、羊草和苜蓿。将风干饲料样品粉碎过1 mm网筛，用于配制试验饲粮。共设计 5个精粗比(60∶40、70∶30、80∶20和 90∶10 和100∶0)，每个精粗比设计 10 种饲粮，共50种试验饲粮。试验饲粮组成见表1，营养水平见表2。

1.3 体外发酵

应用Menke等［12］的体外产气法进行体外发酵。应用容积为150 mL、可计量容积为100 mL的玻璃注射器作为发酵容器，应用能够精确控制温度的生化培养箱控制培养温度。

根据Menke等［12］的方法配制缓冲液。缓冲试剂 A 液:将 CaCl2·H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10.0 g、CoCl2·6H2O 1.0 g 和 FeCl3·6H2O 8.0 g溶解于蒸馏水中，定容至100 mL;缓冲试剂B液:将NaHCO335.0 g和NH4HCO34.0 g溶解于蒸馏水中，定容至 1 000 mL;缓冲试剂 C液:将Na2HPO45.7 g、KH2PO46.2 g 和 MgSO4·7H2O 0.6 g溶解于蒸馏水中，定容至1 000 mL;还原剂溶液:将 1 N NaOH 20 mL和 Na2S·9H2O 3.125 g溶解于475 mL蒸馏水中。将上述溶液按照下列顺序混合:400 mL蒸馏水、0.1 mL A液、200 mL B液、200 mL C液、40 mL还原剂溶液，混合均匀。

试验牛经预饲12 d后，从第13天开始采集瘤胃液。在早晨饲喂后2 h，通过瘤胃瘘管分别从每头牛瘤胃中采集瘤胃液250 mL左右，使用4层纱布过滤瘤胃液，并且混合均匀，置于保温瓶内。用pH计快速测定瘤胃液pH，然后将瘤胃液与缓冲液以1∶2的体积比例混合均匀，并且持续通入CO2气体。

分别称取0.200 0 g风干饲料样品，放入注射器内顶端。每个饲粮设置4个重复。每个注射器内吸取30 mL培养液。将注射器中的气体排净，并密封注射器顶端。将注射器放入39℃的生化培养箱中进行发酵。每批发酵饲料样品设置3个不含饲料样品的注射器作为空白对照。

发酵持续进行48 h。发酵结束时，读取并记录注射器活塞刻度，以计算发酵总产气量。迅速测定培养液pH，分别采集5 mL气体样品和5 mL发酵液样品。向5 mL发酵液样品中加入1 mL浓度为25%偏磷酸溶液，在4℃下高速离心(15 000×g)15 min，取上清液置于-20℃的冰箱中保存。

1.4 测定指标及方法

分别使用 AOAC(1990)［13］的标准方法934.01、920.39和924.05测定饲料的干物质(dry matter，DM)、粗脂肪(ether extract，EE)和粗灰分(ash)含量。应用凯氏定氮法测定粗蛋白质(crude protein，CP)含量。应用Van Soest等［14］的方法测定NDF含量。在测定NDF含量后，直接测定饲料的中性洗涤剂残留物的CP，作为中性洗涤剂不溶粗蛋白质(neutral detergent insoluble CP，NDICP)。

使用气相色谱仪(TP-2060T，北京北分天普仪器有限公司)测定发酵气体中的CH4和CO2产量。测定条件为:热导检测器(TCD)，TDX-01色谱柱，规格1 m×2 mm×3 mm，柱温70℃，检测器温度100℃。载气为氩气(He)。标准气体组成(体积比)为:CH426.796%、CO265.300%、氧气(O2)0.605%、氮气(N2)7.100%、H20.199%。

表1 试验饲粮组成(干物质基础)Table 1 Composition of experimental diets(DM basis) %

续表1

表2 试验饲粮的营养水平(干物质基础)Table 2 Nutrient levels of experimental diets(DM basis)

续表2

使用气相色谱仪(TP-2060F，北京北分天普仪器有限公司)测定发酵液中的VFA产量。测定条件为:火焰离子检测器(FID)，PEG-20M+H3PO4玻璃柱，柱温120℃，检测器温度220℃。载气为 He、H2和空气，流速分别为 30、30和300 mL/min。每个样品取2μL用于分析。标准挥发性脂肪酸的组成为:乙酸42.0 mmol/L、丙酸32.1 mmol/L、异丁酸 2.0 mmol/L、丁酸14.0 mmol/L、 异戊酸 7.0 mmol/L、戊酸3.0 mmol/L、2-乙基丁酸4.0 mmol/L。其中2-乙基丁酸用作内标物。

1.5 计算方法

总 产 气 量、CH4、CO2、总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸和丁酸产量计算方法如下:

式中;Y样品为样品的气体(mL/g)或VFA产量(μmol/g);Y发酵液为发酵液的气体(mL/g)或VFA产量(μmol/g);Y空白为空白的气体(mL/g)或VFA产量(μmol/g);DM为饲料样品干物质含量(g)。

饲料样品的碳水化合物(CHO)和NSC含量(%，干物质基础)计算方法如下:

1.6 数据统计与分析

应用SPSS 16.0分析饲粮精料比与各指标间的相关关系。分析模型为:y=b x+a(式中，y为体外发酵指标，x为饲粮NSC/NDF)。P＜0.05为相关关系显著，P＜0.01为极显著。

2 结果

体外发酵饲粮样品的气体及VFA产量见表3。

2.1 饲粮NSC/NDF与产气量之间的关系

统计分析结果显示，饲粮NSC/NDF(x，%)与体外发酵总产气量(y1，mL/g)、CH4(y2，mL/g)和CO2产量(y3，mL/g)之间均存在极显著的正相关关系(P＜0.01)。

2.2 饲粮NSC/NDF与不同发酵指标比例之间的关系

统计分析结果显示，饲粮NSC/NDF比例(x，%)与体外发酵乙酸/丙酸(y4，%)和 CH4/TVFA(y5，mL/mmol)之间存在极显著的负相关关系(P ＜0.01)，但与 CO2/TVFA(y6，mL/mmol)之间的相关关系不显著(P＞0.05)。

3 讨论

饲料的SC主要包括NDF，NSC主要包括淀粉、可溶性糖和果胶。因此，考虑到碳水化合物组成，饲粮NSC/NDF可被看作更为精确的饲粮精粗比。

本试验结果显示，饲粮NSC/NDF与体外发酵总产气量、CH4、CO2产量以及VFA产量之间均存在显著正相关关系。这说明饲粮的可发酵程度随着饲粮NSC比例的提高而提高。这与饲粮精料比例与各发酵指标之间的相关关系一致。

本试验结果还显示，饲粮NSC/NDF与体外发酵与乙酸/丙酸和CH4/TVFA之间存在显著的负相关关系。说明随着饲粮NSC比例的提高，乙酸的比例下降，丙酸的比例提高，即NSC有利于提高丙酸的产量。另外，随着饲粮NSC比例的提高，CH4的相对产量下降，这与饲粮精料比例与乙酸/丙酸和CH4/TVFA之间的关系一致。

需要指出的是，尽管饲粮NSC/NDF与总产气量、CO2、CH4产量之间存在显著的正相关关系，但所有相关方程的相关系数也偏低。造成这一结果的原因是:1)尽管CH4、CO2是碳水化合物发酵产生的，但CP、EE和粗灰分等均有可能影响碳水化合物发酵，进而影响发酵产物CH4、CO2的产量;2)从理论上讲，饲粮NSC和NDF含量与体外发酵指标之间存在密切的相关关系，但饲粮NSC和NDF含量并不能代表被实际发酵的数量。

Moe等［7］研究表明，奶牛 CH4产量与可溶解残留物(中性洗涤剂可溶解物-CP-EE)、半纤维素和纤维素采食量之间的决定系数R2=0.67，而奶牛CH4产量与消化的可溶解残留物、半纤维素和纤维素之间的决定系数R2=0.73。Kirchgessner等［15］研究表明，反刍动物的饲粮粗纤维、无氮浸出物、CP和EE采食量与反刍动物CH4产量之间的多元决定系数R2=0.69。Jentsch等［5］研究表明，反刍动物DCP、DEE、DCF和可消化无氮浸出物采食量与反刍动物CH4产量之间的多元决定系数R2=0.896。比较上述结果可知，可消化营养成分与反刍动物CH4产量之间的相关关系更为密切，因为可消化营养成分反映了动物对营养成分实际消化利用的过程。

NSC/NDF能够很好地反映饲粮碳水化合物的组成成分，但与瘤胃发酵总产气量、CH4、CO2产量以及乙酸/丙酸、CH4/TVFA、CO2/TVFA之间的相关程度并不高。这可能是因为NSC/NDF并不能反映NSC和NDF在瘤胃中的可发酵程度。可以推测，可发酵NSC/可发酵NDF比例与瘤胃发酵总产气量、CH4、CO2产量以及乙酸/丙酸、CH4/TVFA、CO2/TVFA之间的相关程度可能更高。因此，这一比例可能更适合作为准确预测饲粮瘤胃发酵情况的指标。

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4 结论

高精料饲粮条件下，随着饲粮NSC/NDF的提高，饲粮体外发酵的CH4相对产量下降，但由于相关系数偏低，饲粮NSC/NDF不能作为准确预测饲粮体外发酵CH4产量的唯一指标。

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