黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖对感染肠炎沙门氏菌Caco-2细胞促炎症和抗炎症细胞因子基因mRNA表达水平的影响

李晓敏 刘红宾 呙于明 王 忠

(中国农业大学动物科学技术学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

肠道上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)是肠道黏膜屏障的重要组成部分，除参与水分和营养物质消化和吸收外，也参与宿主肠道黏膜固有免疫［1］。肠道上皮细胞受到食源性肠道致病菌，如沙门氏菌、致病性大肠杆菌侵袭后，可表现免疫炎症反应，产生不同类型细胞因子，进而影响宿主肠道黏膜屏障结构完整性和通透性［2-3］。

沙门氏菌病是主要人畜共患病，也是主要的食源性疾病之一。沙门氏菌血清型较多，目前发现2 000多种，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium，ST)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis，SE)是2种侵袭性强且具有广泛感染宿主的血清型。畜禽是它们重要的感染宿主和贮存宿主，肠道是沙门氏菌入侵的主要靶器官［4］。沙门氏菌可通过编码在沙门氏菌毒力岛Ⅰ上的Ⅲ型分泌系统介导进入肠上皮细胞，该系统分泌的SPI(Salmonella pathogenic island)蛋白能够与肠上皮细胞相互作用，从而触发一系列反应，包括产生促炎性细胞因子，导致局部多形核细胞汇集和大量液体渗出［5-6］。沙门氏菌严重感染时，黏附在肠道黏膜上的沙门氏菌可破坏肠道上皮细胞屏障结构，通过肠道上皮细胞，进入淋巴和血液循环，最终进入肝脏和脾脏，从而造成人或动物表现多种临床症状，如发烧、胃肠炎、腹泻、败血症和死亡，间接污染畜产品。耐过的动物可表现持续性感染和终身带菌，成为主要传染源。因此控制沙门氏菌感染，确保畜禽产品微生物安全，已成为动物生产的重要任务之一［4，7］。

抗生素在预防和治疗沙门氏菌病中发挥了巨大作用，然而抗生素的使用也带来了药物残留、抗药性菌株出现等问题，因此寻找和开发预防和治疗沙门氏菌病的抗生素替代物已成为当前控制沙门氏菌病、确保公共卫生安全的主要任务。近几年，国内外很多研究表明通过营养性添加剂和具有免疫调节作用的非营养性添加剂，如益生菌、益生元、生物活性多糖等手段，来调控宿主非特异性和特异性免疫功能，调节宿主体内促炎症细胞或信号分子和抗炎症细胞或信号分子的平衡等途径来缓解免疫应激或部分清除病原微生物，如沙门氏菌、致病性大肠杆菌感染，保护肠道黏膜屏障结构完整和功能正常，已成为促进动物健康、减少抗生素使用和确保动物性食品安全生产的主要途径之一［8-9］。β -1，3/1，6- 葡聚糖是一种结构复杂的葡萄糖多聚复合物，普遍存在于细菌、酵母、蘑菇、谷类和海藻等的细胞壁中。体内和体外试验已经表明，不同来源的β-1，3/1，6-葡聚糖可增强宿主先天性免疫和获得性免疫功能，增强抗病原细菌、病毒和寄生虫感染的能力，是极具生物活性的免疫增强剂［10］。Sophy 公司的β -1，3/1，6-葡聚糖又可称为“黑酵母菌培养液”，它是将短梗霉菌属的APF-202菌置于培养基中发酵培养后，经过滤和热处理(杀死活菌、停止发酵)所得的“一体化”培养液，是具有很高生理活性的水溶性胞外葡聚糖，并且现在已经能够作为健康食品添加剂应用于市场。这种β-葡聚糖的结构与香菇多糖或裂褶多糖的结构极为相似，张亚茹等［11］研究发现，该β-1，3/1，6-葡聚糖可能通过促进细胞免疫和体液免疫的功能明显抑制S180腹水移植瘤的生长。Ikewaki等［12］采用黑酵母 β-葡聚糖外培养外周血单核细胞(PMBC)，发现其可诱导白细胞介素 -8(IL-8)的产生增加。Yatawara等［13］发现黑酵母β-葡聚糖作为免疫调节剂，通过提高巨噬细胞及自然杀伤细胞(NK细胞)的活性，对黑热病病原体亚马逊利什曼原虫(L.amazonensis)发挥噬菌作用。

然而，关于肠道致病菌感染情况下，黑酵母β-葡聚糖与肠道上皮细胞之间的相互作用机制尚未见报道。为此，本试验以肠上皮细胞Caco-2细胞为模型，旨在探讨当肠上皮细胞受到肠炎沙门氏菌感染后，黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖对肠上皮细胞炎症和抗炎症细胞因子的调节作用，以期进一步揭示其抗感染机制。

1 材料与方法

1.1 材料

黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖来自日本索菲公司(Sophy Inc)，相对分子质量在10万～50万，易溶于水。产品菌株和细胞系:肠炎沙门氏菌菌株(Salmonella enteritidis sterotype，ATCC13076)购自中国兽医药品监察所;人结肠癌细胞系Caco-2细胞购自北京银紫晶生物医药技术有限公司。

主要试剂:最低基本培养液(minimum essential medium，MEM)、青链霉素、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自中科迈晨(北京)科技有限公司。胎牛血清(FBS)购自Gbico公司。12孔细胞培养板购自美国 Corning公司。溶菌肉汤(Luria-Bertani，LB)培养液购自北京益德益华科技发展有限公司。RNeasy Mini Kit购于QIAGEN公司，反转录试剂盒采用MBI Fermentas公司的Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，实时荧光定量PCR试剂盒为TaKaRa公司生产的SYBR Premix EX TaqTMⅡ(Perfect Real Time)。

1.2 Caco-2细胞培养

Caco-2细胞培养的培养液为含有10%FBS、200 U/mL青霉素、200μg/mL链霉素和50μg/mL两性霉素的MEM，容器为75 cm2卡氏培养瓶，将其置于37℃培养箱中，通入5%CO2(相对湿度90%)。2 d换1次培养液，每5 d按1∶3的比例传代，试验所用细胞在10代以内。

1.3 细菌培养和计数

肠炎沙门氏菌在LB培养液中37℃摇床培养24 h，在650 nm下测定菌悬液的OD值(当OD值为0.90时，菌液浓度为 5×108CFU/mL)，4 000 r/min离心15 min，用PBS洗2次，用不含血清和抗生素的MEM悬浮细菌，根据上述OD值调整菌液浓度为1×1010CFU/mL，同时用LB琼脂进行平板计数以确定菌液浓度。

1.4 β-1，3/1，6-葡聚糖和肠炎沙门氏菌共培养

将贴壁生长良好的Caco-2细胞(细胞融合度达到90%以上)用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化处理，细胞计数，然后以5×104个/孔接种到12孔细胞培养板上，细胞培养液为2 mL/孔含10%FBS但不含抗生素的MEM，待细胞达到90%融合时(此时细胞浓度约为1×106个/mL)开始进行分组试验。

试验分成4个组，分别为对照组、肠炎沙门氏菌感染组、β -1，3/1，6-葡聚糖组、β -1，3/1，6-葡聚糖+肠炎沙门氏菌共培养组。每个处理3个重复，每孔为1个重复。Caco-2细胞培养3～5 d(中间每隔1 d换1次不含抗生素只含10%FBS的 MEM)，待细胞长成单层后，β -1，3/1，6-葡聚糖组和β-1，3/1，6-葡聚糖组+肠炎沙门氏菌共培养组各孔，弃去旧培养液，加入用不含抗生素只含10%FBS的MEM稀释的终浓度为40μg/mL的黑酵母 β-1，3/1，6-葡聚糖溶液(原浓度为50μg/mL)。而培养基对照组和肠炎沙门氏菌感染组各孔仍换成新鲜的不含抗生素只含10%FBS的MEM。β-1，3/1，6-葡聚糖组预处理细胞24 h，肠炎沙门氏菌感染组和 β-1，3/1，6-葡聚糖+肠炎沙门氏菌共培养组分别加入20μL预先备好的肠炎沙门氏菌菌液，使最终浓度在1×108CFU/mL(细菌与细胞比例为100∶1)，其余2组加入同体积MEM，处理3 h，收集细胞提取总RNA。

1.5 总RNA提取和反转录

采用 RNeasy Mini Kit(Qiagen，USA)提取细胞总RNA，采用核酸蛋白测定仪于260和280 nm处检测RNA的浓度和纯度。cDNA合成按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit操作说明进行，反应结束后-20℃保存备用。

1.6 实时荧光定量PCR扩增

以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，进行实时荧光定量PCR，实时荧光定量PCR引物见表1(所有引物由上海生物工程公司设计和合成)。实时荧光定量 PCR采用 SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ(TaKaRa公司)操作说明书在ABI 7500 real-time PCR仪进行扩增。20μL反应总体系:cDNA 2μL，上、下游引物各0.8μL(工作浓度为10μmol/L)，焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水 6 μL，SYBR Premix EX TaqTM10 μL，ROX Reference 0.6 μL。反应条件为:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环。相对定量法计算各个目的基因含量，基因表达定量结果分析采用比较阈值法:2-ΔΔCt=PCR 扩增完成后用熔解曲线分析法确定产物特异性。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers

1.7 数据分析

应用SPSS 17.0软件的one-way ANOVA进行方差分析，P＜0.05时为差异显著，P＜0.01时为差异极显著。

2 结果

由表2可见，在正常生理情况下，对照组Caco-2细胞炎症和抗炎症细胞因子均无明显表达;Caco-2细胞分别用肠炎沙门氏菌感染和β-1，3/1，6-葡聚糖处理后，与 Caco-2细胞对照组相比，均极显著地上调了促炎症细胞因子白细胞介素 -1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)基因、趋化因子IL-8基因mRNA表达水平(P＜0.01)，同时也极显著地上调了抗炎症细胞因子白细胞介素-10(IL-10)基因mRNA表达水平(P＜0.01)，然而对抗炎症细胞因子TGF-β基因mRNA表达水平无显著影响(P＞0.05)。β-1，3/1，6-葡聚糖和肠炎沙门氏菌与Caco-2细胞共培养之后，与单纯肠炎沙门氏菌感染组相比，β-1，3/1，6-葡聚糖显著地下调了细胞因子IL-1β、IL-8和 TNF-α基因 mRNA表达水平(P＜0.05)，显著上调了 IL-10、TGF-β基因mRNA表达水平(P＜0.05)。为验证产物特异性，绘制目的基因与内参基因熔解曲线如图1。

表2 β-1，3/1，6-葡聚糖、肠炎沙门氏菌和Caco-2细胞共培养对细胞因子基因mRNA表达水平的影响Table 2 Effects of Caco-2 cells in co-culture with β-1，3/1，6-glucan and Salmonella enteritis on cytokine gene mRNA expression levels

3 讨论

本试验以Caco-2细胞为模型，通过分析β-1，3/1，6-葡聚糖对肠炎沙门氏菌感染Caco-2细胞后主要炎症和抗炎症细胞因子基因mRNA表达水平，揭示其抗肠道病原菌感染的免疫机理。

细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导免疫细胞(如单核/巨噬细胞、淋巴细胞等)和非免疫细胞(如成纤维细胞、血管内皮细胞、肠道上皮细胞等)产生的一类能在细胞间传递信息的低分子质量可溶性蛋白质或多肽，具有调节白细胞生理功能，参与调节炎症反应，参与免疫应答和抗感染、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。促炎性细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素 -6(IL-6)、TNF-α、干扰素 - γ(IFN-γ)、IL-12，抗炎性细胞因子如 IL-10、TGF-β、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-13(IL-13)，趋化因子如CXC类趋化因子IL-8等，在参与和调节炎症反应，维持机体正常免疫生理状态、抵抗感染中发挥主要作用。

图1 各基因熔解曲线Fig.1 The melt curves of the genes

本试验发现肠炎沙门氏菌感染Caco-2细胞后，除极显著上调炎症细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-8基因mRNA表达水平外，也显著上调了抗炎症细胞因子IL-10基因mRNA表达水平，但对TGF-β基因mRNA表达水平无显著影响。炎症细胞因子的变化趋势与以前报道一致。黄颖等［11］报道肠炎沙门氏菌可诱导Caco-2细胞显著表达和分泌IL-8。Eckmann等［12］报道沙门氏菌感染肠道上皮细胞(T84、Caco-2细胞)可显著上调趋化因子IL-8和促炎症细胞因子IL-6和TNF-α基因mRNA表达水平和分泌量。同样，体内和体外大量试验也表明沙门氏菌感染可刺激哺乳动物或家禽免疫系统或免疫细胞类型，如单核/巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞和树突状细胞等表达和分泌许多细胞因子，如促炎症细胞因子(如 IL-1、TNF-α和IL-6)、趋化因子［如巨噬细胞炎性蛋白 -1α (macrophage inflammatory protein，MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白 -1β(MIP-1β)、巨噬细胞炎性蛋白 -2α(MIP-2α)和胶质细胞趋化因子(keratinocyte chemoattractant，KC)］以及其他一些细胞因子［白细胞介素-12p70(IL-12p70)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等］［2，12-14］。本试验中肠炎沙门氏菌感染 Caco-2细胞后抗炎症细胞因子TGF-β基因mRNA表达水平的变化趋势与Bahrami等［2］报道一致，然而抗炎症细胞因子IL-10基因mRNA表达水平变化趋势与以往报道［2，12，15］不一致，这些研究者认为沙门氏菌感染可下调或不改变动物肠道上皮细胞IL-10基因mRNA表达水平，但是 Bahrami等［2］报道空肠弯曲杆菌可诱导肠道上皮细胞系HT-29细胞显著表达IL-10基因，关于肠道致病菌诱发肠道上皮细胞表达抗炎症细胞因子的具体原因尚需进一步探讨。总体来看，上述试验结果表明，尽管感染的宿主细胞类型不同，但沙门氏菌感染均可诱发宿主表现炎症反应。这些炎症细胞因子在吸引白细胞、T细胞等到炎症部位，激活机体先天性免疫和获得性免疫系统，抵抗沙门氏菌感染中发挥了主要作用［12，16］。此外，也有研究表明，一些肠道致病菌，如沙门氏菌、致病性大肠杆菌的外膜蛋白抗原物质［如脂多糖(LPS)等］可通过免疫细胞表面模式识别受体(pattern recognization receptor，PRR)，如 Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs)、dectin-1和清道夫(scavenger)受体，激活细胞内核转录因子-κB(NF-κB)信号通路，通过调节细胞表达和分泌免疫调节相关细胞因子从而调节免疫炎症反应［16-18］。肠道上皮细胞表面也存在一些模式识别受体，如 TLRs［19］。沙门氏菌的 LPS是否也通过识别Caco-2细胞表面TLRs而诱导其表达免疫调节相关细胞因子，值得进一步探讨。

同时，本试验中单纯应用水溶性黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖刺激 Caco-2细胞后，促炎症细胞因子 IL-1β和 TNF-α基因、趋化因子 IL-8基因及抗炎症细胞因子IL-10和TGF-β基因mRNA表达水平的变化趋势与肠炎沙门氏菌感染完全一致。具体原因可能与肠炎沙门氏菌感染肠道的外膜糖蛋白LPS与β-1，3/1，6-葡聚糖结构相似，均属微生物多糖，属相同的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，且识别细胞表面相同的模式识别受体 PRR，如TLRs、dectin-1 和 scavenger 受 体［20］。 然 而，β-1，3/1，6-葡聚糖是一种有效的免疫调节剂，可刺激Caco-2细胞表达促炎症因子和抗炎症细胞因子，是一种增强肠道黏膜免疫抵抗力的表现，间接增强巨噬细胞活性，而沙门氏菌的LPS诱发肠道上皮细胞表达炎症细胞因子趋势是一种免疫炎症反应，主要间接导致多形核细胞和白细胞聚集［4］。同样，体内和体外大量研究也表明，β-1，3/1，6-葡聚糖可调节机体免疫系统或免疫细胞表达不同类型细胞因子［10］，从而增强宿主免疫机能。

本试验结果表明，与单纯肠炎沙门氏菌感染组相比，黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖和肠炎沙门氏菌共培养后，可显著降低肠炎沙门氏菌诱发Caco-2细胞产生的炎症反应，表现为炎症细胞因子IL-1β和 TNF-α基因、趋化因子 IL-8基因 mRNA表达水平显著下调，而抗炎症细胞因子IL-10和TGF-β基因mRNA表达水平显著上调。同样，体内试验也表明β-1，3/1，6-葡聚糖可通过下调炎症细胞因子，如IL-1β和TNF-α基因及上调抗炎症细胞因子IL-10基因、诱发免疫细胞呼吸爆发和吞噬细胞能力增强等来抵抗一些肠道致病菌，如沙门氏菌、致病性大肠杆菌感染［10，21］。总之，本试验结果说明，黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖对肠道致病菌感染诱发肠道黏膜免疫炎症反应有抑制作用。从Caco-2细胞受体介导的细胞信号传导途径探讨β-1，3/1，6-葡聚糖激活Caco-2细胞表达和分泌细胞因子而抵抗肠道致病菌感染的分子机制，是未来值得探讨的内容。

4 结论

黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖能通过下调促炎性细胞因子和上调抗炎性细胞因子的表达抑制肠炎沙门氏菌感染引起的肠道上皮细胞的免疫炎症反应。

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