胎猪BMSC体外构建软骨的实验研究

刘李娜 何爱娟 周广东 曹卫刚

骨髓间充质干细胞 （Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作为良好的软骨组织工程种子细胞来源，已被广泛认可[1]。与脂肪间充质干细胞、胚胎干细胞和脐带干细胞等相比，BMSCs具有来源广泛、体外扩增能力强、成软骨分化能力高[2-4]、异体移植免疫原性低[5]及伦理接受度高等优点。随着软骨体外构建技术的不断成熟，现在已经能利用BMSCs在体外构建出成熟的组织工程软骨[6]。但是，自体组织工程软骨构建周期长、种子细胞来源有限，难以使组织工程软骨的构建实现规模化、产品化。寻找合适的种子细胞是构建异体组织工程软骨的重要问题。根据年龄不同，BMSCs可分为成年期BMSCs、新生期BMSCs和胎龄期BMSCs。其中，成年期BMSCs已被证实可以作为软骨再生的种子细胞[1]，但是作为异体移植软骨种子细胞来源，胎龄期BMSCs扩增能力更好，免疫原性更低[7]。为此，我们选取上海白猪为动物模型，通过比较胎猪BMSCs和成年猪BMSCs的细胞形态学、三向诱导能力及三维成软骨能力，进一步评估利用胎猪BMSCs作为软骨再生种子细胞来源修复异体软骨缺损的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

高糖DMEM、低糖DMEM、胎牛血清、胰酶、三抗（Hyclone公司，美国）；地塞米松、胰岛素、牛血清白蛋白、L-谷氨酰胺、维生素C、油红O染料（Sigma公司，美国）；转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素转铁蛋白亚硒酸 （ITS）（R&D公司，美国）；PGA（国睿生命科技有限公司，中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 胎猪BMSCs、成年猪BMSCs的分离与培养

胎猪BMSCs的分离与培养[8]：孕猪（孕期70 d）肌肉注射氯胺酮麻醉，建立静脉通道，按常规开腹手术准备，左侧卧位，沿最后一肋下方10 cm处平肋弓作10 cm切口，取出子宫，切开，暴露胎猪，迅速结扎脐带后置入75%乙醇，浸泡30 min，在超净台铺无菌手术巾，取出胎猪四肢长骨，用血管钳钳碎长骨，用含10%胎牛血清的低糖DMEM冲洗，将冲洗出的骨髓液接种于10 cm2培养皿，置入37℃、5%CO2培养箱中培养24～72 h，弃悬浮细胞，加入含5 ng/mL bFGF的新鲜培养基继续培养，每3天换液一次，待细胞长至80%融合后，用0.25%的胰酶消化并传代。

成年猪BMSCs的分离与培养[9-10]：成年猪肌注氯胺酮麻醉后，于髂前上棘处剃毛、消毒铺巾，以肝素润湿骨穿针后穿刺，每只猪抽取10～15 mL骨髓液。骨髓液中加入20 mL低糖DMEM，1 800 r/min离心8 min，弃上层脂肪悬液，以每皿2 mL接种于10 cm2培养皿中，置入37℃、5%CO2培养箱中培养。5 d后吸去原培养液，用无菌PBS缓冲液冲洗，尽量洗去培养液中的血细胞，观察细胞生长状况。加入含5 ng/mL bFGF的新鲜培养基继续培养，每3天换液一次，待细胞长至80%融合后，用0.25%的胰酶消化并传代。

1.2.2 绘制细胞增殖曲线

取第3代胎猪 BMSCs、成年猪 BMSCs，胰酶消化，制备成单细胞悬液，以5 000个/孔的细胞密度接种于96孔板。于接种后1～7 d，每孔加入10 μL CCK-8试剂，轻轻混匀后置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养4 h。应用酶标仪检测450 nm每组OD值，每天测得数据取3孔平均值，统计分析，绘制增殖曲线。

1.2.3 胎猪BMSCs、成年猪BMSCs多向分化比较

1.2.3.1 成脂肪分化及检测

取第3代胎猪BMSCs和成年猪BMSCs的细胞在6孔板中培养2 d，待细胞融合80%左右后，加入成脂诱导培养液（含10%胎牛血清，2 nM谷氨酰胺，0.5 mM 异丁基甲基黄嘌呤，1 μM 地塞米松，10 μM胰岛素和200 μM吲哚美辛的高糖DMEM培养液），每3天换液一次，以普通培养液为对照组。诱导3周后行油红染色。

1.2.3.2 成骨分化及检测

取第3代胎猪BMSCs和成年猪BMSCs的细胞在6孔板中培养2 d，待细胞融合80%左右后，加入成骨诱导培养液（含10%胎牛血清，2 mM谷氨酰胺，10 mg/L 维生素 C，2.16 g/L β-磷酸甘油，40 ng/mL地塞米松的低糖DMEM培养液），每3天换液一次，以普通培养液为对照组。诱导3周后行茜素红染色。

1.2.3.3 成软骨分化及检测

取第3代胎猪和成年猪BMSCs各0.4×106个细胞在离心管中离心形成pellet后，加入成软骨诱导培养液 （含2 mM谷氨酰胺，10 ng/mL转化生长因子-1，4 mM HCl，1%BSA，50 ng/mL 胰岛素生长因子-1，40 ng/mL 地塞米松，50 μg/mL 维生素 C，40 μg/mL Proline，1×ITS的高糖DMEM培养液），每3天换液一次，以普通培养液作为对照组。诱导3周后行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。

1.2.4 组织工程软骨的体外构建

1.2.4.1 支架材料的准备

取14 mg PGA加入2 mL针筒中加压塑形，滴加1%的PLA定型，75%乙醇浸泡，无菌PBS冲洗3次，吸去PBS，加培养液预培养12 h。

1.2.4.2 接种种子细胞及成软骨诱导

取第4代胎猪和成年猪BMSCs以1×108cells/mL的浓度接种于无菌PGA/PLA支架材料上，接种后4 h用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液培养，48 h后换软骨诱导液培养。体外诱导8周后，取材。

1.2.5 组织工程软骨的评价

1.2.5.1 大体观察

观察取材标本的大小、形状、质地和色泽。

1.2.5.2 组织学检测

取材，4%多聚甲醛固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片，HE、Safranine-O染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察标本的组织结构、软骨基质着色及Ⅱ型胶原表达情况。

1.2.5.3 GAG含量测定

Alcian Blue法检测构建的软骨组织中GAG的含量。

1.2.5.4 总胶原含量测定

利用羟脯氨酸试剂盒检测构建软骨组织中总胶原的含量。

1.3 统计分析

计数资料均以均数±标准差表示。采用SPSS 19.0统计软件包进行分析，采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

镜下显示BMSCs呈梭形、三角形，胞质圆润透亮，呈集落样贴壁生长。与成年猪BMSCs相比，胎猪BMSCs细胞形态比较狭长，细胞核较大，生长速率较快，传代后形态无明显改变（图1）。

图1 体外培养的BMSCs细胞形态（第3代，100×）Fig.1 The morphology of the tissue engineered cartilage in vitro(P3,100×)

2.2 细胞增殖曲线

细胞增殖曲线显示，传代培养的潜伏期约为24～36 h，传代培养细胞的对数增殖期约为2～3 d，对数增殖期后第5天进入平台期。胎猪BMSCs和成年猪BMSCs倍增时间分别为30 h和60 h。细胞每传一代，细胞数增长2倍。从生长曲线中可以看出，胎猪BMSCs的增殖速度明显快于成年猪BMSCs（图2）。

图2 胎猪BMSCs和成年猪BMSCs增殖曲线Fig.2 The growth curve of fetal pig BMSCs and adult pig BMSCs

2.3 胎猪BMSCs、成年猪BMSCs三向诱导对比

成骨诱导21 d后茜素红染色，胎猪BMSCs镜下可见大块深染钙结节分布，体积、数量明显高于成年猪BMSCs。成脂诱导21 d后Safranine-O染色，胎猪BMSCs细胞中可见大量密集圆泡样脂滴，含有脂滴的细胞数目和脂滴体积明显高于成年猪BMSCs。成软骨诱导21 d后行Ⅱ型胶原染色，胎猪BMSCs诱导成pellet和成年猪BMSCs成pellet相比，组织学无明显差别（图3）。

图3 BMSCs成骨、成脂和成软骨三向诱导Fig.3 The osteogenic,adipogenic and chondrogenic differentiation of BMSCs

图4 体外构建组织工程软骨大体观Fig.4 The gross observation of the tissue engineered cartilage in vitro

2.4 体外构建组织工程软骨大体观

体外经过8周的成软骨诱导，新生软骨均呈乳白色，有一定弹性及韧性，大小和支架材料接近，未见回缩。胎猪BMSCs构建的软骨与成年猪BMSCs相比，软骨弹性更好，中空现象不明显（图4）。

2.5 体外构建组织工程软骨组织学检测

2.5.1 HE染色

胎猪BMSCs构建的软骨陷窝结构比较多见，内有细胞核，核大多位于陷窝中央，核仁明显，周围有蓝染的细胞外基质沉积，中空现象不明显。成年猪BMSCs的陷窝结构比较幼稚，并可见较多的散在残留的未降解的PGA纤维纵横排列在许多陷窝之间，中空现象明显（图5）。

图5 体外构建软骨（8周）组织学和免疫组化染色（40×）Fig.5 The histology and immunohistochemistry staining of the tissue engineered cartilage in vitro(8 weeks)(40×)

2.5.2 Safranin－O 染色

胎猪BMSCs和成年猪BMSCs构建的软骨均产生了富含GAG的细胞外基质，胎猪BMSCs构建的软骨比成年猪BMSCs具有更强烈的GAG表达，在中心区域尤为明显（图6）。

图6 体外构建软骨（8周）总胶原含量及GAG含量Fig.6 The total collagen content and GAG content of the tissue engineered cartilage in vitro(8 weeks)

2.5.3 Ⅱ型胶原免疫组化

两组软骨中Ⅱ型胶原的聚集、分布与aggrecan相似，成年猪BMSCs构建的软骨在组织的外周区域Ⅱ型胶原高度表达，而胎猪BMSCs具有更均质和强烈的表达（图5）。体外GAG检测表示，胎猪BMSCs和成年猪BMSCs均产生了含Ⅱ型胶原和aggrecan的软骨细胞样的ECM，但是胎猪BMSCs比成年猪BMSCs具有更多的ECM分泌和更加均一的分布。

2.6 体外构建组织工程软骨定量测定结果比较

体外诱导8周，胎猪BMSCs和成年猪BMSCs构建软骨的平均GAG含量分别为（40.37±3.24）mg/g和 （26.58±2.67）mg/g，成年猪BMSCs构建的软骨GAG含量仅达到胎猪BMSCs构建的软骨GAG含量的65.8%，两组间存在显著差异（P<0.01）。两组标本平均总胶原含量分别为 （2.07±0.16）mg/g和（1.15±0.20） mg/g， 成年猪 BMSCs构建的软骨总胶原含量仅达到胎猪BMSCs构建的软骨总胶原含量的 55.6%，两组间存在显著差异（P<0.01）（图 6）。

3 讨论

组织工程技术的兴起为软骨缺损修复提供了新的治疗途径。BMSCs是目前软骨构建的最佳种子细胞之一，在关节软骨缺损的修复中已经取得了积极的进展[11-12]。但是，自体来源的BMSCs来源有限、体外构建时间长，难以满足软骨构建产品化的需求。因此，寻找合适的种子细胞是组织工程软骨产品化的首要问题。研究发现，BMSCs具有免疫调节功能[13]，而胚胎来源的BMSCs和成体BMSCs相比，具有体外扩能增力强、免疫原性低[7]等特点，成为潜在的同种异体再生软骨的种子细胞。然而，胚胎来源的BMSCs目前尚缺乏较为系统的研究。本研究拟通过对胎猪BMSCs和成年猪BMSCs体外构建软骨能力进行系统比较，初步探讨胚胎BMSCs构建软骨组织的可行性和可能存在的优势。

在形态上，BMSCs可贴壁生长，以梭形的成纤维样细胞为主，有研究发现BMSCs在体外培养过程中多次传代后细胞为长梭形，核异染色质减少，核仁明显，胞浆中可见粗面内质网，分泌活跃，表明其可能为一种自我更新能力已经很弱的终末分化细胞[14]。然而，我们的研究发现，胎猪BMSCs增殖速度快，不易老化，并且细胞贴壁形态至第3代未发生改变，保持梭形或倒三角形，细胞均匀透亮，提示胎猪BMSCs能够体外维持自身生长特性。

三向诱导和体外三维软骨构建结果提示，胎猪BMSCs比成年猪BMSCs有更好的干细胞特性，其成骨和成脂肪能力均强于成年猪BMSCs，是组织工程骨、软骨和脂肪良好的种子来源。

胎猪BMSCs和成年猪BMSCs诱导成pellet的组织学结果，没有明显差别，但是两种细胞体外三维构建软骨的组织学和定量结果则有明显差别。胎猪BMSCs构建的软骨明显优于成年猪BMSCs构建的软骨，胎猪BMSCs作为种子细胞体外构建的软骨更加均质，中空现象不明显，细胞外基质更加丰富。可能的原因有：①胎龄间充质干细胞特性更好，成软骨能力更强；②胎龄BMSCs生成软骨的速度快于成年BMSCs，在材料未降解之前已经生成软骨；③胎龄BMSCs相比于成年BMSCs有更强的抵抗材料降解形成的酸性代谢产物的能力。综合以上的原因，胎龄BMSCs在三维支架上构建软骨的能力优于成年BMSCs，胎龄BMSCs能构建出质量更好的软骨。

综上所述，本研究通过对胎猪BMSCs和成年猪BMSCs作为种子细胞构建组织工程软骨进行系统比较，证明胎猪BMSCs在体外培养体系中能构建出质量更好的软骨组织，为软骨组织工程产品化提供了新的前景和希望。但是胎龄BMSCs作为种子细胞构建的软骨能否成功修复同种异体软骨缺损，尚有待进一步的实验研究。

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